Роль апоптозу в патогенезі захворювань.

Відео: Розлади Кровообігу (Частина 1)

Белушкіна М.М. https://science-faculty.net.ru/lek/apoptosis.htm
Інститут біоорганічної хімії ім. М.М.Шемякіна і Ю.А.Овчіннікова РАН

Апоптоз в багатоклітинних організмі.

Проблема дослідження молекулярних механізмів запрограмованої загибелі клітини стала в останні роки однією з найважчих і актуальних проблем біологічних наук. Труднощі цієї проблеми, очевидна: незважаючи на велику кількість експериментальних даних, до сих пір залишаються нс дослідженими механізми цього явища, не до кінця з`ясована регуляція апоптозу окремих клітин в цілісному багатоклітинних організмі. Актуальність цієї проблеми визначається взаємозв`язком порушення регуляції процесу запрограмованої загибелі клітини з більшістю захворювань. Виявлення конкретних механізмів порушення регуляції апоптозу, супроводжуваних конкретними захворюваннями, дозволить визначити етіологію і патогенез даних захворювань. І як наслідок цього - можливість корекції порушення регуляції запрограмованої загибелі клітини.

Для запрограмованої загибелі клітини закріпився термін - апоптоз (від грецького apoptosis -опаданіе). Мабуть, явище апоптозу в еволюції з`явилося з появою багатоклітинних організмів для регуляції чисельності клітин і встановлення певних взаємовідносин між окремими клітинами в цілісному організмі. Еукаріотичні клітини - це "громадські" істоти. Для їх розвитку необхідний контакт із собі подібними. Взаємовідносини клітин один з одним в багатоклітинних організмі давно привертають дослідників. І це не випадково, тому що саме завдяки цьому, клітини вступають на стадії життєвого шляху, такі як розподіл, ріст, розвиток, диференціювання і, як це з`ясувалося зовсім недавно - на шлях загибелі клітини. Слід зауважити, що проблеми загибелі клітини вченими приділялося значно менше уваги, ніж іншим етапам життєвого шляху клітини. І це, не дивлячись на те, що перші висловлювання про існування процесу загибелі клітин в багатоклітинних організмі з`явилися ще в кінці XIX. Однак роком визнання апоптозу як фізіологічного явища, вважається 1972 рік, коли англійські дослідники Kerr, Wyllie, Currie представили переконливі морфологічні докази існування цього явища.

Приклади апоптозу клітин в організмі.

У процесі онтогенезу і ембріогенезу.

Апоптоз відіграє життєво важливу роль в процесі ембріонального і онтогенетичного розвитку. Він спостерігається при різних морфогенетичних процесах.

Добре досліджена апоптотична загибель клітин при ембріональному розвитку безхребетних тварин, наприклад нематоди (Chaenorhabditis elegans). Запрограмована клітинна загибель спостерігається при метаморфозу комах. Вивчено також запрограмована клітинна загибель в процесі ембріогенезу вищих хребетних - при розвитку очі ссавців, серця, нервової сістеми.Нарушеніе апоптозу в ембріогенезі може призводити до внутрішньоутробної загибелі плоду, природженої потворності або різних захворювань, в тому числі і злоякісних новоутворень.

У тканинах дорослого організму.

У дорослому організмі апоптоз поширений в різних типах тканин. Він зустрічається як в повільно пролиферирующей популяції клітин (гепатоцити, клітини епітелію кори надниркових залоз), так і в швидко проліферуючих клітинних популяціях. У першому випадку він виконує функцію гомеостатічсской регуляції оптимального обсягу тканини. У другому випадку роль апоптозу, в основному, пов`язана з диференціюванням клітин.

При патологічних станах.

Апоптотична загибель клітин спостерігається при різних патологічних станах. Цим шляхом здійснюється загибель клітин в ендокринно-залежних тканинах, при зменшенні концентрації відповідного гормону (наприклад, клітин простати після кастрації і кори надниркових залоз після придушення синтезу АКТГ глюкокортикоїдами). Загибель клітин шляхом апоптозу відбувається також при зменшенні кровопостачання органу (ішемічна хвороба серця).

Шляхом програмованої клітинної загибелі відбувається видалення клітин, виживання яких небажано для організму, наприклад мутантних клітин або клітин, заражених вірусом. В останньому випадку цей процес має важливе біологічне значення, оскільки фрагментація ДНК попереджає перенесення генетичного матеріалу в інші клітини.

Вплив радіації викликає апоптоз в проліферуючих клітинах епітелію кишечника і в непроліферірующей клітинах імунної системи.

Тобто апоптоз є широко поширеним общебиологическим механізмом, відповідальним за підтримання сталості чисельності клітин, формоутворення, вибракування дефектних клітин.

Різні шляхи загибелі клітини.

Апоптоз як явище вперше був описаний морфологами. Грунтуючись на мікроскопічною картиною гине клітини, вони встановили, що клітини гинуть, принаймні, двома шляхами:

некроз і апоптоз. При некрозі клітини набухають, їх мітохондрії та інші органели розширюються (внаслідок порушення роботи іонних каналів) і розриваються внутрішньоклітинні і плазматична мембрани клітини (рис. 1). В результаті цього активуються лізосомальніферменти, а внутрішньоклітинний вміст, потрапляючи в позаклітинне середовище, викликає запальні процеси. Класичні причини, що призводять до некрозу клітини -гіпертермія, інгібування окисного фосфорилювання, гліколізу або циклу Кребса, гіпоксія, дія комплементу або різних токсинів.

Відмінною морфологічної рисою апоптозу є колапс ядра. Хроматин, який в нормі представлений відкритими і конденсованими областями (гетеро- і еухроматин), стає суперконденсірованним в формі півмісяця по периферії ядра. У цей момент починається фрагментація ДНК. На ранніх стадіях апоптозу, на відміну від некрозу, клітина навпаки, зморщується, втрачаючи до 1/3 свого обсягу за кілька хвилин. Механізм цього явища досі не вивчений, але, безсумнівно, в цей процес повинні залучатися транспорт іонів і води. Важливою особливістю цього процесу є те, що не відбувається пошкодження мембран клітини. Всихання добре виражено як у культурі клітин, так і в тканинних зрізах, де апоптотична клітина відділяється від сусідніх клітин. Далі апоптотична клітина перетворюється в сукупність оточених мембраною апоптозних тілець різних за своїм складом, які фагоцитуються макрофагами або сусідніми клітинами. Клітка на даному етапі ще жива (включення летального барвника трипанового синього не відбувається). Мабуть в цьому і є завдання апоптозу - утилізація ще живих апоптозних тілець, поки вміст клітини не потрапляє в позаклітинне середовище, не викликаючи запальних явищ. Тобто знищення клітин шляхом апоптозу забезпечує мінімальне пошкодження тканин в порівнянні з іншими механізмами смерті.

Причини апоптозу.

Феномен апоптозу є результатом дії різних факторів, що призводять до загибелі клітини (рис. 2). Це можуть бути неспецифічні фактори, такі як температура, токсичні агенти, оксиданти, вільні радикали, g- і УФ-випромінювання, бактеріальні токсини і ін. У всіх цих випадках відбувається індукція апоптозу, але при збільшенні дози відповідного агента розвивається некроз клітини. Оскільки апоптоз фізіологічне явище, то в організмі повинні бути фактори, що призводять до апоптозу клітини. До теперішнього часу відомо, що апоптоз можуть викликати як внутрішньоклітинні сигнали, так і зовнішні, що опосередковують свою дію через рецепторні системи, які самі по собі не є токсичними чи деструктивними. В цілому, якщо йдеться про фізіологічні чинники, то слід застосовувати термін регуляція апоптозу клітини, оскільки відома група фізіологічних активаторів і інгібіторів апоптозу. Фізіологічні регулятори апоптозу клітини викликають підвищений інтерес дослідників. В першу чергу розглянемо регуляцію апоптозу клітин гормонами. В ендокринології давно відомо, що видалення ендокринної залози призводить до масової інволюції клітин-мішеней. Механізм цього явища довго не був відомий, і тільки відкриття явища апоптозу дало поштовх до вивчення процесів, що лежать в основі дії гормонів на життєздатність клітин. Так, кастрація призводить до атрофії железісітих клітин простати.

Введення андрогенів запобігає цей процес. Тобто андрогени є інгібіторами апоптозу для клітин простати. У той же час вони є індукторами апоптозу для фолікулярнихклітин яєчника. На даному прикладі можна бачити, як одні і ті ж гормони є інгібіторами апоптозу для одних клітин і індукторами апоптозу для інших. Також вивчено протилежну дію по регуляції апоптозу одним і тим же гормоном в залежності від стадії диференціювання клітини. Так естрогени є інгібіторами апоптозу епітелію матки на початку менструального циклу і індуктором апоптозу - в кінці циклу. Інгібітором апоптозу епітелію матки в кінці циклу будуть прогестсрона. На прикладі статевих гормонів ми розглянули фізіологічну регуляцію апоптозу клітин в залежності від типу клітин і стадії їх диференціювання. Центральне місце в дослідженні апоптогенних дії гормонів належить вивченню впливу глюкокортикоїдів (ГК) на лімфоїдні клітини.

Чутливість незрілих тимоцитах до ГК-індукованому апоптозу характерна для багатьох біологічних видів, в тому числі для людини, гризунів і птахів. Чутливість Т-клітин до ГК залежить від стадії розвитку лімфоцитів. Пре-Т-клітини кісткового мозку і незрілі Т-клітини тимуса чутливі до фізіологічних доз ГК. Раніше вважалося, що зрілі медулярная тімоціти і периферичні лімфоцити резистентні до ГК. Однак недавно було показано, що певні субпопуляції зрілих Т-лімфоцитів (натуральні кілери, цитотоксичні Т-лімфоцити) зазнають апоптоз під дією ГК. В-клітини також чутливі до ГК залежно від стадії свого розвитку.

Пре-В-клсткі і незрілі В-клітини гинуть шляхом апоптозу під дією ГК. Зрілі В-лімфоцити нечутливі до ГК.

Дія гормонів опосередковано внутрішньоклітинними специфічними рецепторами (для даних наведених прикладів). Рецептор, пов`язуючи ліганд, регулює транскрипцію гормоно-чутливих генів. Це можуть бути гени, продукти яких регулюють просування клітини по клітинному циклу або апоптоз-специфічні гени. Іншими важливими фізіологічними регуляторами апоптозу є цитокіни. Цитокіни - це велика група білків, що регулюють проліферацію і диференціювання клітин при зв`язуванні зі специфічними рецепторами на клітинах мішенях. На відміну від гормонів, цитокіни діють, в основному, на пара- і аутокрінним рівні. Цитокіни підрозділяються на 3 великі групи (в залежності від структури і функції): ростові фактори (колониестимулирующие фактори, епідермальний фактор росту, інсуліно-подібний фактор росту і т.д.), сімейство Фактора некрозу пухлини (ФНП) і спіральні цитокіни (інтерлейкіни, інтерферони). Ефект цитокінів на клітини також неоднозначний: для одних клітин вони виступають в ролі індуктора апоптозу, для інших - в ролі інгібітора апоптозу. Це залежить від типу клітини, від стадії її діф4) еренціровкі, від функціонального стану клітини.

Найбільш добре вивчена послідовність подій, що призводять клітку до апоптозу в результаті взаємодії білків з сімейства ФНП зі специфічними рецепторами. Яскравим представником цієї групи білків є система Fas / Fas-L. Слід зазначити, що для цієї системи не відомі інші функції, крім як індукції апоптозу клітини. Fas / APO-l / CD-95-рецептор, за структурою, що відноситься до рецепторів сімейства ФНП. Взаємодія Fas з Fas-L (ліганд) або з моноклональними антитілами призводить до апоптозу клітини. Fas конститутивно експресується на поверхні клітин багатьох типів: на тимоцитах, лімфобластоідних клітинних лініях, активованих Т- і В-лімфоцитах, а також на фібробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, мієлоїдних клітинах. Людський Fas складається з 325 амінокислотних залишків і відноситься до мембранних білків I типу. Тобто в його структурі можна виділити позаклітинний, трансмембранний і цитоплазматичний домени. Гомологія амінокислотної послідовності серед рецепторів сімейства ФНП висока. Приблизно 80 амінокислотних залишків утворюють домен смерті (DD), який залучається до білок-білкове взаємодія з цитоплазматичними білками, генеруючи сигнал смерті. Ген Fas у людини локалізована в довгому плечі хромосоми 10 і складається з 9 екзонів.

Fas-L є цитокіном і відноситься до сімейства цитокінів ФНП. Fas-L експресується на активованих Т-лімфоцитах і натуральних кілерів, а також на клітинах Сертолі і паренхімних клітинах передньої камери ока, що дозволяє цим клітинам вбивати будь-яку Fas-експрсссірующую клітку, в тому числі і активоване Т-лімфоцит. Цей механізм визначає появу захищених від імунної системи місць. Fas-L існує в двох формах - нерозчинної або мембранозв`язаних і розчинної, відщеплюється від клітини за допомогою металлопротеінази. Розчинна форма людського Fas-L зберігає свою активність. Подібно до інших лигандам рецепторів сімейства ФНП, Fas-L - гомотрімер зв`язується з 3 молекулами Fas.

При зв`язуванні ліганда з рецептором відбувається олігомеризація цитоплазматических білків: (1) DD (домен смерті), що відноситься до рецептора, (2) Адапторная білка - FADD (Fas-асоційований домен смерті), що містить DED - еффекторний домен смерті і (3) прокаспази- 8 (рис. 3). В результаті цього процесу відбувається активація апоптоз-специфічної протеази - каспаз-8 і розвиваються характерні для апоптозу процеси. Мутації в гені fas або в гені fas-L призводять до розвитку аутоімунних захворювань.

Важлива роль в регуляції апоптозу клітин імунної системи належить іншим цитокинам -інтерлейкінам, інтсрферонам. Інтенсивно ведуться роботи по з`ясуванню апоптогенних дії интерлейкинов (ІЛ). Було виявлено, що вони є індукторами апоптозу як в здорових, так і в онкологічних клітинах і клітинних лініях. Наприклад, ІЛ-12 індукує апоптоз натуральних кілерів, ІЛ-4 та ІЛ-10 - периферичних моноцитів людини, ІЛ-10 - Т-лімфоцитів. Однак не тільки роль індукторів апоптозу властива інтерлейкіну, не менше виражений ефект цитокінів спостерігається в запобіганні апоптозу. При цьому один і той же ІЛ може бути як індуктором апоптозу, так і його інгібітором. Відмінності у відповіді клітин спостерігаються для різних клітин-мішеней і, можливо, залежать від ступеня їх диференціювання і розвитку. Так, наприклад, ІЛ-1 є індуктором апоптозу для клітин мишачої тіоми в разі пригнічення розмноження клітин (фаза плато на кривій росту) і інгібітором апоптозу для цих же клітин в разі їх інтенсивного розмноження (фаза росту). ІЛ-2 є інгібітором апоптозу Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів. ІЛ-4 також інгібує апоптоз Т-лімфоцитів і В-лімфоцитів. ІЛ-3, ІЛ-6, ІЛ-9 відомі тільки як інгібітори апоптозу клітин.

Неоднозначна і роль інтерферонів (ІФ) за впливом на клітини. В одних випадках ІФ (викликає апоптоз (клітини кісткового мозку), в інших - є інгібітором апоптогенних сигналу (периферичні моноцити людини).

Цікаві дані стосуються регуляції апоптозу пептидними ростовими факторами. Є переконливі дані про те, що фактори росту запобігають розвитку апоптозу в клітинах. Видалення чинників зростання з культури клітин призводить до типових апоптотических проявам.

Таким чином, апоптоз є тим механізмом, який обумовлює елімінацію клітин з певною специфічністю рецепторів. Наявність в організмі фізіологічних чинників -індукторов і інгібіторів апоптозу дозволяє зробити висновок, що програмована загибель клітини залежить від співвідношення факторів, що викликають апоптоз і запобігають його, а також від регуляторних внутрішньоклітинних механізмів.

Роль протеолізу в розвитку апоптозу.

В даний час складається враження про центральну роль протеаз в запуску і розвитку процесу апоптозу. Причому, мабуть, при апоптозу, на відміну від фізіологічного відповіді клітини, діють свої, характерні тільки для апоптозу, спеціалізовані незворотні реакції протеолізу, каталізуються специфічними протеазами, що відносяться до класу цистеїнових протеаз. Ця група протеаз, названа каспаз (caspases), існує відокремлено і функціонує як медіатор сигналу смерті. З - відображає механізм протеолізу. Тобто в активному центрі знаходиться цистеїн. Асп - позначає аспарагиновую кислоту, яка впізнається як субстрат, пептидний зв`язок після неї піддається гідролізу. Аза - закінчення, властиве ферментам. До теперішнього часу в різних клітинах ссавців виявлено 10 каспаз, що утворюють ферментативний каскад, подібно ферментативному каскаду згортання крові або системи комплементу. Каспаз мають високу ступінь гомології по своїй амінокислотноїпослідовності, схожі за структурою і за субстратної специфічності. Вони синтезуються у вигляді проферментов (30-50 кД), які містять 3 домена: N-кінцевий домен, велику субодиницю (20 кДа) і малу субодиницю (10 кДа). Під час активації каспаз піддаються протеолитическому отщеплению N-кінцевого домену, що відрізняється найбільшою варіабельністю як за розмірами, так і по амінокислотної гомології.

Цей процесинг між доменами супроводжується асоціацією великої і малої субодиницею в гетеродімер з формуванням активного центру. Кристалічна структура двох каспаз (caspase-1 і caspase-3) визначена: в обох випадках гетеродімер асоційований в тетрамер з формуванням 2 каталітичних сайтів (рис. 5), Серед каспаз розрізняють Ефектори, тобто ферменти безпосередньо гідролізуючі структурні білки клітини, і індуктори - каспаз, які приймають апоптотичні сигнал і передають його на ефекторні каспаз. Серед молекулярних мішеней каспаз - ефекторів відомі багато білків, деградація яких викликає розвиток незворотних процесів, характерних для апоптозу. Яким чином відбувається регуляція активності каспаз в інтактною клітці? Каспаз присутні в клітці конституційно (навіть в нейронах, що не оновлюються протягом усього життя), що дозволяє індукувати апоптоз швидко. Один із шляхів активації каспаз пов`язаний із взаємодією індуктора апоптозу зі специфічними рецепторами (наприклад, активація каспаз-8 при взаємодії Fas - ліганда з Fas-рецептором). Інший шлях - активація каспаз-9 в результаті освіти гетеродімери білками сімейства Вс1-2 (буде розглянуто далі). Третій шлях активації каспаз - за допомогою гранзіми В - серинових протеази. Такий шлях активації каспаз актуальний в разі індукції апоптозу клітини цитотоксичними Т-лімфоцитами, які і секретують ці ферменти. При такому способі активації каспаз необхідна присутність пороутворюючих білків перфорінов, що продукуються також цитотоксическими Т-лімфоцитами. В якості мішеней гранзіми У відомі каспаз 1, 3 і 9.

Апоптоз-специфічна фрагментація ДНК.

Одне з апоптотических подій реалізується в ядрі клітини і полягає в фрагментації ДНК. Деградація ДНК є термінальною фазою апоптозу. В ході деградації ДНК спочатку відбувається утворення великих фрагментів, що містять приблизно 300 тис. Пар основ (тис. П.о.), дещо пізніше - 30-50 тис. П.о. Далі настає наступний етап фрагментації ДНК - її межнуклеосомная деградація, з формуванням фрагментів, що містять 180 п.о. (Протяжність нитки ДНК в нуклеосоме) або кратних їм за величиною. Саме ці фрагменти виявляються у вигляді "драбинки" при електрофорезі ДНК лизатов апоптотических клітин, який широко використовується для ідентифікації апоптозу. Така фрагментація ДНК пов`язана з протеолітичним розщепленням специфічного білка топоізомерази II. Це білок виконує структурну і ферментативну функції і бере участь у формуванні структур ДНК вищого порядку - суперспіралізованних петель. Вони містять по 50 тис. П.о. Шість петель, об`єднаних в єдину дисковидную розетку, утворюють ще більш складну структуру і мають в своєму складі відповідно по 300 тис. П.о. Слід нагадати, що саме на фрагменти по 50 і 300 тис. П.о. розщеплюється ДНК в початковій стадії деградації при апоптозу. Деградація топоізомерази II каспазами є однією з причин фрагментації ДНК.

Також субстратом протеаз при апоптозу є гистон H1, який захищає ДНК від дії ендонуклеаз на межнуклеосомальном рівні. В результаті цього розщеплення відбувається деградація ДНК на фрагменти близько 180 п.о. і кратні їм.

Здійснення різних етапів деградації ДНК пов`язують з проявом активності різних ендонуклеаз. Мало відомостей про характеристику ендонуклеаз, що обумовлюють появу великих фрагментів ДНК. Трохи більше відомостей про процеси межнуклеосомальной деградації ДНК, в результаті якої утворюються фрагменти ДНК розміром 180 п.о. Вважають, що цей тип деградації забезпечується активацією Са2 +, Mg2 + залежної ендонуклеази.

Механізми індукції апоптозу при пошкодженні ДНК.

До останнього часу вважалося, що нерепаріруемие пошкодження ДНК призводять клітку до загибелі в результаті порушення функцій всіх біохімічних систем через неможливість повноцінної транскрипції генів, що містять дефекти в матриці ДНК. Дослідження останніх років призвели до формування принципово нових уявлень про механізм загибелі клітин, що мають пошкодження ДНК, як про процес, що здійснюється відповідно до певної генетичної програмою. В індукції цієї програми при наявності пошкоджень в ДНК клітини важлива роль належить білку р53. Цей білок з молекулярною масою 53 кДа локалізована в ядрі клітини і є одним з транскрипційних факторів, підвищена експресія якого призводить до репресії ряду генів, що регулюють транскрипцію і причетних до затримки клітин в фазі клітинного циклу G1. При пошкодженні ДНК під дією іонізуючого випромінювання або УФ-випромінювання, інгібіторів топоізомерази II і деяких інших впливах відбувається активація експресії гена р53. Блок клітинного циклу в фазах G1 і G2 до реплікації ДНК і мітозу, відповідно, робить можливою репарацію пошкодженої ДНК, запобігаючи таким чином появу мутантних клітин. Якщо ж активність репараційних систем недостатня і пошкодження ДНК зберігаються, то в таких клітинах індукується програмована клітинна загибель, або апоптоз, що призводить до захисту організму від присутності клітин з пошкодженою ДНК, тобто мутантних і здатних до злоякісної трансформації.

На рівні транскрипції р53 регулює експресію генів, що беруть участь в блокаді клітинного циклу - р21 (інгібітор більшості циклин-залежних кіназ, або взаємодіє або з комплексами, що визначають синтез і репарацію ДНК, або з білками, що модулюють апоптоз - Вах. Послідовність розглянутих подій представлена на рис . 7.

Мутації гена р53 дозволяють таким клітинам зберігати життєздатність в мітозі, що загрожує виживанням клітин, які зазнали пухлинної трансформації. І дійсно, при онкологічної трансформації виявлено значну кількість мутацій гена р53. Мутації гена р53 пов`язані з поганим прогнозом в лікуванні злоякісних новоутворень. Такі пухлинні клітини виявляються резистентними до променевої та хіміотерапії. І, навпаки, пухлини з нормальним (диким типом) р53 - легко піддаються лікуванню.

Таким чином, при дії генотоксичних агентів р53 не тільки збільшує час репарації ДНК. але також захищає організм від клітин з небезпечними мутаціями. Блокування процесу апоптозу, що відбувається на різних стадіях канцерогенезу, призводить до зниження здатності трансформованих клітин активувати програму клітинної загибелі, що визначає прогресію пухлинного захворювання.

Роль білків сімейства Вс1-2 в регуляції апоптозу клітини.

Процес регульованої клітинної загибелі умовно може бути розділений на декілька різних фаз: фаза ініціації апоптозу, проведення сигналу, активація каспаз, активація ендонуклеаз і специфічна деградація ДНК, в результаті чого настає загибель клітини.

Якщо початкові фази різняться в залежності від типу клітин і від апотоз-індукує сигналу, то етап деградації ДНК - універсальний для більшості клітин. Ця фаза є переходом до незворотної - термінальній стадії апоптозу, яку контролюють білки сімейства Вс1-2, похідні однойменних генів (рис. 8). У зв`язку з цим, з`ясування ролі білків сімейства Вс1-2 займає центральне місце у вивченні регуляції процесу апоптозу. До теперішнього часу відомо, що білки цього сімейства відносяться або до індукторів апоптозу (Bad, Bax, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak), або до інгібіторів (Bcl-2, Bcl-XL). Білки сімейства Bcl-2 знаходяться в постійному динамічному рівновазі, утворюючи гомо- і гетеродімери, що в кінцевому рахунку впливає на розвиток апоптозу клітин. Тому вважається, що співвідношення активних форм цих білків визначають реостат життя і смерті клітини. Механізм регуляції цього процесу доцільно розглядати з позиції структурно-функціональних взаємовідносин між білками цього сімейства, які дозволяють об`єднати їх в одну родину - білків сімейства Bcl-2.

Шляхи активації білків сімейства Bcl-2.

До теперішнього часу показано, що вирішальним моментом у запуску апоптозу є гетеродімерізація білків сімейства Bcl-2 - індукторів та інгібіторів апоптозу. Яким же чином білки сімейства Bcl-2 отримують сигнал до регуляції апоптозу від цих рецепторів? До теперішнього часу вивчена здатність модулювати стан білків сімейства Bcl-2, по крайней мере, 3 різними механізмами.

Перший механізм (рис. 10, 11) пов`язаний зі зміною структури білка - індуктора апоптозу -Bad, а саме його ступеня фосфорилювання / дефосфорилирования. Здійснюється цей механізм через рецептор інтерлейкіну-3 (ІЛ-3). ІЛ-3, зв`язуючись зі специфічним рецептором, активує специфічні кінази, які здійснюють фосфорилювання Bad, що збільшує його спорідненість до цітоплазматічсскому білку. При цьому не відбувається утворення гетеродимера Bcl-2 / Bad і апоптоз не розвивається. У відсутності ІЛ-3 активуються фосфатази, що призводить до дефосфорілірованіе Bad, утворення гетеродімери Bcl-2 / Bad і запуску процесу апоптозу за рахунок вивільнення мітохондріальних факторів. Нещодавно встановили, що таким фактором є цитохром С, а також апоптоз-індукує фактор, який, мабуть, є протеазой. Вивільнення цих факторів призводить до розпаду комплексу Bcl-2 / Apaf-1 / неактивна каспаза-9, що призводить до активації каспаз-9.

Інший механізм регуляції функціонального стану білків сімейства Bcl-2 також пов`язаний з фосфорилюванням / дефосфорілірованіе білків -індукторов апоптозу за допомогою кінази Raf-1, яка активується через специфічні Raf-1 рецептори за участю G-білка - Ras. При надходженні специфічного апоптогенних сигналу

відбувається фосфорилювання білка Вах, що зменшує його здатність утворювати гетеродімери з Bcl-2, в результаті чого відбувається інгібування апоптоза.Третій механізм можливого інгібування білка Bcl-2 пов`язаний з отриманими нещодавно даними, що стосуються білка Bag-1. Білок Bag-1 здатний взаємодіяти з Bcl-2 і з цитоплазматическим доменом рецептора для гепатоцелюлярного фактора росту і тромбоцитарного фактора росту. При відсутності в середовищі цих факторів Bag-1 пов`язаний з Bcl-2. При взаємодії цих факторів зі специфічними рецепторами, Bag-1 взаємодіє з цитоплазматическим доменом цього рецептора, звільняючи Bcl-2, що призводить до апоптозу. Ймовірно, існує досить багато способів регулювати на клітинному рівні функціональну активність білків сімейства Вс1-2 як інгібіторів, так і індукторів апоптозу за допомогою певних сигнал-передавальних молекул і шляхів, які активуються ними. З огляду на функціональну важливість білків сімейства Bcl-2 в регуляції такого складного і багатостороннього процесу, як апоптоз, можна стверджувати, що ці білки є перспективною мішенню для різних маніпуляцій з метою впливу на бажану долю клітини.

Терапія на основі апоптозу.

Таким чином, апоптоз є общебиологическим механізмом, відповідальним за підтримання сталості чисельності клітинних популяцій, а також формоутворення і вибракування дефектних клітин. Порушення регуляції апоптозу призводить до виникнення різних захворювань, пов`язаних з посиленням або, навпаки, пригніченням апоптозу. Отже, вивчення механізмів регуляції різних етапів даного процесу дозволить певним чином впливати на його окремі етапи з метою їх регуляції або корекції. В даний час загальноприйнято: якщо клітина гине від апоптозу - мається на увазі можливість терапевтичного втручання, якщо внаслідок некрозу - немає. На основі знань про програмованої загибелі клітини використовується широкий ряд препаратів з метою регуляції цього процесу в різних типах клітин. Так, відомості про рецептор-опосередкованої регуляції апоптозу клітин дозволяють використовувати їх для терапії гормон-залежних новоутворень. З використанням андроген-блокуючої терапії лікують рак простати. Рак молочної залози часто піддається регресії при застосуванні антагоністів естрогенових рецепторів. Інформація про біохімічні сигнал-передавальних коліях регуляції апоптозу дозволяє ефективно застосовувати антиоксидантну терапію, а таюке використовувати препарати, що регулюють концентрацію кальцію, або активують (інгібуючі) різні протеїнкінази, з метою корекції апоптозу в різних типах клітин. Усвідомлення ролі апоптозу в загибелі клітин інтенсифікували пошук фармакологічних засобів, що захищають їх від апоптозу. Активно вивчаються інгібітори специфічних протеаз як фармакологічних агентів. Це, як правило, три- або тетрапептіди, що містять аспарагін. Обмеженням їх терапевтичного використання є їх низька здатність проникати в клітку. Однак, незважаючи на це, в експериментах in vivo отримані успішні результати при використанні N-бензілоксі-карбоніл-Vа1-А1А-Аsр-фторметілкетона інгібітора різних каспаз для зниження зони інфаркту при моделюванні інсульту. У найближчі роки можна очікувати появи нових лікарських препаратів для лікування і попередження різних захворювань, в основі дії яких буде закладено принцип регуляції процесів апоптозу.

Багатообіцяючими є також підходи, пов`язані з регулюванням апоптоз-специфічних генів і реалізуються, зокрема, в генній терапії - однієї з найбільш перспективних галузей сучасної медицини - при лікуванні захворювань, викликаних порушенням функціонування окремих генів. Ідентифікація морфологічних і біохімічних маркерів апоптозу повинна в перспективі сприяти більш глибокому розумінню механізмів патогенезу захворювань, поліпшенню диференційної діагностики і створення принципово нових напрямків терапії.