Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

Відео: Школа-семінар з сучасних методів проточної цитофлюориметрії

• Загальні принципи проточної цитометрії
• Аналіз ДНК-гістограм
• Аналіз параметрів клітинного циклу
• Найбільш вживані методики
• Застосування цитометрії в молекулярної клінічній діагностиці

Відео: 11 - Назіпова Нафиса Наіловна: Структурно-функціональна організація геному

Можливості застосування методів кількісної цитометрії в біологічних і медичних дослідженнях дуже широкі. Вони включають безліч завдань, начінаяот пошуку найбільш інформативних морфометричних і цітоспектрофотометріческіхкрітеріев кінетики ДНК в клітинному циклі і закінчуючи многопараметріческімізученіем гетерогенних популяцій досліджуваних об`єктів. Хоча ці завдання могутрешаться на різних експериментальних моделях або клінічному матеріалі, загальні принципи залишаються однаковими як для тих, так і інших об`єктів.

В даний час цитометрию прийнято поділяти на проточну і статичну. Перший варіант цитометрії здійснюється з допомогою спеціальних приладів -проточних цитометров і сортерів. Для статичної цитометрії можуть бутивикористані конфокальні мікроскопи, а також більш прості і дешеві сістемианаліза зображень, змонтовані на звичайних люмінесцентних мікроскопах.Существует багато методик, які з однаковим успіхом можна відтворювати як за допомогою проточної, так і статичної цитометрії. Більш того, статична цитометрия в деяких випадках позволяетполучіть ширшу інформацію про клітинах, причому її продуктивність не набагато менше проточної.

Справжній огляд літератури присвячений застосуванню цитометрії для оцінки параметрів клітинного циклу на експериментальному і клінічному матеріалі. Хоча в огляді а передусім наводяться відомості, що стосуються проточної цитометрії, з учетомізложенного вище вони в значній мірі поширюються також і настатіческую цитометрию.

1. Загальні принципи проточної цитометрії

Метод проточної цитометрії сформувався за останні 30 років на основі отдельнихопитов за підрахунком числа частинок і визначення їх розмірів. У 1965 р появілосьпервое повідомлення про клітинному сортер, а в 70-х роках стали випускати прилади, здатні вимірювати інтенсивність флуоресценції при двох і більше довжинах хвиль і определятьсразу кілька клітинних параметрів.

В даний час випускають два основних типи приладів для проточної цитометрії: 1) прості у використанні апарати, які можуть вимірювати флуоресценцію при двох і більше довжинах хвиль ісветорассеяніе під кутом близько 10 (малокутове пряме розсіювання) і90 - 2) великі клітинні сортери, які не тільки вимірюють п`ять і більше клітинних або ядерних параметрів, але і сортують частіцис заданим набором цих параметрів.

Принципи проточної цитометрії дуже прості. Клітини або ядра поодинці пересекаютсфокусірованний світловий пучок, зазвичай лазерний. Світло певної длінивозбуждает молекули флуоресціюючих барвників, пов`язаних з разлічниміклеточнимі компонентами, при цьому при цьому може відбуватися одночасне порушення кількох різних барвників, що дозволяє оцінити відразу кілька клітинних параметрів. Світло, іспускаемийкрасітелямі, збирають за допомогою системи лінз і дзеркал і розкладають накомпоненти. Світлові сигнали детектируют, перетворять в електричні імпульсиі далі в форму, зручну для комп`ютерної обробки і зберігання інформації.

Методом проточної цитометрії можна отримувати найрізноманітніші дані: визначати вміст у клітині ДНК і РНК, сумарна кількість білків і кількість специфічних білків, узнаваемихмоноклональнимі антитілами, досліджувати клітинний метаболізм (наприклад, вимірювати внутрішньоклітинний рН), вивчати транспорт іонів кальцію і кінетікуферментатівних реакцій (MGOrmerod, 1990).

У продажу є різні проточної цитометрії, і викласти загальні принципи їх работисложно. Можна відзначити лише кілька моментів, загальних для всіх приладів:

- для аналізу необхідні гомогенні суспензії ізольованих клітин -

- клітини або ядра повинні бути в достатній кількості -

- для усунення ефектів, пов`язаних з можливою агрегацією клітин, необхідно використовувати всю доступну інформацію, наприклад дані з розсіювання світла вобсязі і ставлення площі піка до його ширині.

2. Аналіз ДНК-гістограм

Вимірювання вмісту ДНК - одне з найпростіших і розповсюджених застосувань проточної цитометрії. ПервиеДНК-гістограми, отримані в 1969 р (M.A.Van Dilla, T.T. Trujillo, P.F.Mullaney, J.R.Coulter, 1969), дозволили чітко розрізнити клітини, находящіесяв G1-, S- і G2 / М-фазах клітинного циклу. З тих пір з`явилося множестворабот по вимірюванню змісту ДНК в клінічному матеріалі, отриманому а передусім від хворих на рак.

З ДНК-гістограм можна отримати два роду даних. По-перше, ідентіфіціроватьклеткі з аномальним вмістом ДНК (рис.1, Б), так звані анеуплоїдних клітини. По-друге, визначити частку клітин, що знаходяться в S -фазі (SPF), і оцінити ступінь проліферації. Як правило, в клітинній популяції з високою проліферативною активністю число клітин в S -фазі більше, ніж зазвичай.

Міжнародний комітет з аналітичної цитометрії (W.Hoddeman, J.Schumann, M.Andreeff, B.Barlogie, CJHerman, RCLief et.al, 1984) попиталсястандартізіровать безліч способів аналізу ДНК-гістограм, і тим не менш дляаналізу продовжують використовувати різні підходи , часто з прівлеченіемкомпьютерних прграмм. Далі будуть розглянуті деякі з цих підходів:

Обчислення коефіцієнта варіації (CV)

Найпростіший спосіб оцінки якості результатів заснований на обчисленні CV для G1-піку ДНК диплоїдних клітин. Ця величина визначається з наведеного нижче співвідношення впредположеніі, що G1 -пік слід нормальному розподілу:

CV = W / (M · 2,35),

Де W - ширина піка на рівні напіввисоті, М - номер каналу для максимуму G 1 - піку.

Чим менше CV і чим краще G 1 -пік відповідає нормальному розподілу, тим якісніше результати. У действітельностікачество ДНК-гістограм, як правило, не дуже високо, і щоб судити одостоверності результатів, отриманих при клінічних дослідженнях, пріходітсяоценівать середній CV і діапазон його значень.

Обчислення індексу ДНК

Індекс ДНК для «анеуплоїдних» піку (піків) на гистограммах з двома або більше G1 -пікамі (рис.1, Б) обчислюють, орієнтуючись на «диплоїдний» G 1 -пік. Так, на рис. 1, Б G 1 -піку для пухлинних клітин відповідає вдвічі більшу кількість ДНК, ніж G 1 - піку диплоїдних клітин, тому індекс ДНК для нього дорівнює 2,0. Для анеуплоїдних клітин, що містять на 50% більше ДНК, ніж нормальні, індекс дорівнює 1,5. Анеуплоїдія можна виявити тольков тих випадках, коли на гистограммах є не менше двох G 1 - піків. Щоб встановити, який з близько розташованих один до одного G 1 - піків відповідає диплоїдним клітинам зі свіжих зразків тканини, можна використовувати зовнішній ДНК-стандарт. Якщо прісутствуюттолько диплоїдні клітини, то ІД вважають рівним 1,0.

Основна проблема при визначенні плоїдності пов`язана з трудністю виявлення малого чіслаанеуплоідних стовбурових клітин. Ще важче ідентифікувати малочісленниететраплоідние стовбурові клітини, оскільки такі клітини в G 1 - фазі за вмістом ДНК рівноцінні диплоїдним клітинам у фазі G 2. Так, на відміну від рис 1, Б, на якому чітко видно високий «тетраплоїдний» пік, на рис.1 , А виявляється лише слабкий пік, відповідний чотирьом гаплоїдний набором ДНК.

Визначення частки клітин, що знаходяться в S- фазі

Для визначення частки клітин в S -фазі використовується метод Байсха і ін. (H.Baisch, W.Gohde, W.A.Linden, 1975), модифікований стосовно канеуплоідним клітинам. Суть методу полягає в побудові прямокутника, вписується в простір між G 1 - і G 2 -пікамі. Висота цього прямокутника визначається числом клітин, що припадають на 10 центральних каналів області S-фази, з якого обчислюється середня кількість клітин на канал. Аналогічним способомможно визначити частку анеуплоїдних клітин в S -фазі за умови, що висоту прямокутника (рис.1, Б) можна обчислити, використовуючи ту частину гістограми, яка не перекривається з областю, отвечающейдіплоідним клітинам.

3. Аналіз параметрів клітинного циклу

Завдяки фундаментальним дослідженням у галузі експериментальної біології і клінічної медицини були отримані факти, що стосуються кінетікіклеточного циклу.

До теперішнього часу вже накопичено певний досвід роботи з даного питання. Практично не існує ниодного органу або тканини людського організму, експериментального тваринного, який би не піддавався цитометричного або цітоспектрофотометріческомуаналізу. На підставі цих даних встановлено, що зміст ДНК нормальних соматичних клетоксоответствует диплоїдний набір хромосом (2с) і характеризується одніммодальним класом на ДНК-гістограмі. Значення цього параметра для одного і того ж індивіда може коливатися в пределах30%. Найбільш виражені варіації у змісті ДНК спостерігаються в клітинах проліферірующіхорганов - печінки і селезінки. Ці дані були отримані при определеніісодержанія ДНК в ядрах клітин різних органів і тканин фенотіческі здоровихлюдей (130 проб - по 5 - 14 від кожного випадку) (E.Muller, R.Weidhase, 1983).

У досліджуваних об`єктах схематично представлені фази мітотичного циклу іраспределеніе ДНК в різних тканинах. Розраховувалася кінетика клеточнойпроліфераціі, а в патологічно зміненому органі - ступінь вираженностіпроцесса, особливо в разі ракової пухлини.

Завдяки використанню в дослідженнях скануючих і проточних цитофотометрія определениважние дані, що стосуються класифікації клітин за фазами мітотичного циклу, атакож отримані результати, що дозволяють оцінити тривалість і дісперсіюсоответствующіх фаз циклу G 1, S, G 2 + M.

Однопараметричними аналіз кінетики клітинного циклу з вивчення змісту ДНК показав возможностіколічественной цитометрії та відкрив широкі перспективи щодо егоіспользованія для дослідження та поглиблення знань по досліджуваному питанню.

В даний час з`явилися дані, які значно розширюють традіціонноепредставленіе, що стосується розподілу клітин в чотирьох послідовних фазахцікла. Одночасне вивчення двох параметрів - ДНК і білка, ДНК і РНК - даетсущественно більше інформації про кінетику клітинного циклу, так як позволяетразделіть зливаються фази циклу, такі, як G 0 + G 1, G 2 + M, а також ідентифікувати додаткові фази в пресинтетичному ( G 1) і постсинтетическом (G 2) періодах. При аналізі Пресинтетичний періоду в експерименті та клінічному матеріалі була показана можливість використання АТ (ДНК і РНК) для додаткової класифікації G 1 -періодана GIQ, GIA, GIB і G2A, G2B (Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980).

На культурі клітин Hela з використанням мічених радіоактивних ізотопів і проточної цитометрії виділені в постсинтетическом періоді клітини, які стосуються ранньої (G2A) і пізньої (G2B) фазах клітинного циклу (O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979).

Pollack і ін. (A.Pollac, H.Moulis, NLBlock, GLIrvin, 1984) при цитометричного аналізі ДНК і білка (FITC / PI) в клітинах трьох різних експериментальних моделей, які включають культуру лейкозних опухолевихклеток щурів FL4, микрокультуру лімфоцитів периферичної крові людини HPBL, що не стимульованих і стимульованих фитогемагглютинином (ФГА), а також матеріалу солідної пухлини у вигляді перевівной аденокарциноми передміхурової залози щурів R 3327 = Q показав можливість поділу пресинтетичний періоду на три фази, виділивши в ньому покояться клітини GIQ, ранні GIA та пізні G 2B клітини, в постсинтетическом періоді були відповідно виділені ранні G2А і пізні G2B клітини. Для затримки вхожденіяклеток в S -фазу використовували актіноміцідін D, оксімочевіну, для блоку мітотичних клітин застосовували колцемідом.

У роботі також представлені дані, що свідчать про можливість класифікації проліферуючих лімфоїдних і лейкозних пухлинних EL4 клітин в різні терміни культивування на відповідні S-фази клітинного циклу з роздільним виділенням в них M- і G 2 - фаз. Виходячи з представлених даних, очевидно, що проточний цитометричного аналіз по двумпараметрам є одним з перспективних методів оцінки кінетики клеточногоцікла, що дозволяє провести ідентифікацію клітин, що знаходяться в ранеенеопределяемих фазах циклу (G1A, G1B і G2A, G2B), і визначити клітини, що знаходяться у фазах M і G 2.

У деяких роботах клінічного напрямку використовується двухпараметріческійаналіз клітинного матеріалу з досить успішної класифікацією патологіческіхпроцессов, наприклад при розпізнаванні доброякісних і ракових процессовмочевого міхура, шийки матки, а також для класифікації різних формгемобластозов.

У сучасній літературі досить широко представлені дані поцітоспектрофотометріческому вивчення інтерфазних ядер. Слід зазначити, чтоособую цінність представляють роботи, спрямовані на вивчення мітотіческіхклеток з подальшим аналізом хромосом. Відомо, що зміни, регістріруемиев хромосомах, можуть бути визначальними діагностичними маркерами пухлини, особливо на початкових етапах виникнення злоякісного процесу. Однакоіспользуемие методи аналізу хромосомного матеріалу порівняно складні ітрудоемкі. Тому останнім часом поряд зі звичайними цітогенетіческіміметодамі дослідження каріотипу нормальних і малігнізованих клітин сталіпріменяться скануючі і проточні цитометрические аналізатори. Пріборипоследнего типу забезпечують досить високу точність і швидкість вимірювання, а також відтворюваність результатів. Швидкість аналізу хромосом в протокесоставляет 1000 - 2000 хромосом в секунду. Проточний цитометричного аналіз ДНКметафазних хромосом в суспензії є абсолютно новим методомкаріотіпірованія. Тому в дослідженнях такого роду основний акцент делаетсяна розробці ефективних методів сепарації інтактних хромосом із збереженням іхцелостності і морфологічної структури.

У представлених роботах найчастіше досліджуваної моделлю є метафазниехромосоми, отримані з клітин китайського хом`ячка і людини, пріготовленниедля прямого каріотипування, а також для аналізу каріотипу з кратковременнимілі тривалим культивуванням клітин. Для аналізу генетичного матеріалаіспользуются однопараметричними проточні системи, де проводиться аналіз та сортування хромосом по інтенсівностіфлуоресценціі в комплексі з такими флуорохромами, як PI, EtBr, Ho 33258, а також застосовуються високоразрешающем проточної цитометрії з двухлазерной системою, коториеобеспечівают біваріантний аналіз ДНК, мічений двома флуорохромами. Большейчастью використовують поєднання Але 33258, специфічно зв`язується з АТ-богатиміучасткамі ДНК, і хромомицина А 3, селективно взаємодіє СГЦ-парами.

Дані, отримані за допомогою автоматизованих систем, представляються в відегістограмм, так званих проточних каріограмм. Про якість аналізасвідетельствует високий дозвіл гістограм, Які характерізуютсямножественнимі вузькими піками, що відносяться до різних класів хромосом. Колічествопіков в більшості випадків відповідає набору хромосом, яке характернодля даного індивідуума. При дослідженні клітин зародка китайського хомячкаметодом проточного каріотипування на етапі експоненціального зростання биліполучени все 11 піків, відповідні 11 парам хромосом самки, ісследуемогожівотного (J.A.Steinkamp, 1984).

Зазвичай застосовуються цитогенетичні методи не дозволяють ідентифікувати Y -хромосому з G- і F-груп хромосом людини. Застосування проточної цитометрії дозволяє вирішити цю задачу. Так, налімфоцітах, виділених з периферичної крові донорів-чоловіків, скратковременним культивуванням (52 год) і добавлентем колцемідом була показанавозможность визначення позиції Y-хромосомою по інтенсівностіДНК-флуоресценції (Але 33258) у вигляді піку на проточній каріограмме. У 17обследуемих донорів позиція Y-хромосомою на гістограмі варіювала. У деяких спостереженнях пік Y-хромосомою знаходився між 19 і 20 хромосомами, в інших - між 20-й і 17-й. У 70% випадків Y- хромосома була контаміновані з 20-ї.

З робіт, присвячених хромосомному аналізу, відомо, що при використанні однолазерний проточною системи можетбить ідентифіковано близько 15 хромосом людини, виключаючи Y -хромосому.Прімененіе двухлазерной системи (FACS-11) дозволяє по інтенсивності флуоресценції розпізнати близько 20 популяцій хромосом в метафазних пластинках і, що особливо цінно, ідентифікувати маленькі аутосоми людини (M.Lalande, RRSchreck, R.Hoffman, SA Latt, 1985). У цьому випадку крім флюорохромів Але 33258 і хромомицина А 3в комплекс субстрат-флюорохром вводиться третій барвник: нетропсін або дістаміцін А. Це сприяє отриманню додаткової інформації про специфіку хромосом, т.е.определенію структурних особливостей нормальних і атипових хромосом. У результатебіваріантного проточного аналізу з додатковою забарвленням хромосом авторамудалось на моделі клітинної лінії людських лимфобластов отримати високоеразрешеніе метафазних пластин з наступним вивченням структурної перестройкіхромосом і ідентифікацією аномальних.

Проточний біваріантний аналіз, який використовується для кариотипа хромосом, апробований надостаточно широкому спектрі клінічного і експериментального матеріалу, включаяопухоль прямої кишки, культури клітин асцитичної рідини, лімфоцітовперіферіческой крові і фібробластів людини (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).

4.Наіболее вживані методики, використовувані в цитометрії клітинного циклу.

При проточної цитометрії можна сканувати від 100 до кількох тисяч клітин в секунду, що дозволяє дуже швидко отримати достовірні результати. Однакотакім способом можна аналізувати тільки дуже розбавлені клеточниесуспензіі. Солідні тканини необхідно спочатку дезагреговані, що всегдасопровождается порушенням морфології. Клітини монослоя зазвичай діспергіруютобработкой трипсином в присутності ЕДТА.

Дезагрегація свіжих солідних пухлин

Методи дезагрегации клітин можна поділити на три групи:

- методи, засновані виключно на механічній обробці -

- ферментативні методи -

- методи виділення ядер

Найпростіші і швидкі методи дезагрегации включають тільки механічну обробку тканин. Ці методи особливо хороші длярихлих тканин (наприклад, лімфатичних вузлів) і дозволяє отримувати густиесуспензіі клітин за кілька хвилин. Для отримання неочищених клеточнихсуспензій можна використовувати аспірати солідних пухлин, взяті з помощьюшпріца.

Ферментативний метод дозволяє отримати досить концентровану клітинну суспензію ізразнообразних пухлин, але при великих витратах часу.

Для виділення ядер (зазвичай з тканин, частково дезагреговані механіческімпутем) розроблені різні методи, засновані на використанні ферментів, детергентів або тих і інших. Детальна процедура дезагрегации тканин, фарбування препаратів, полученіярезультатов і їх аналізу для суспензії ядер розроблена Вінделовом і ін. (L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990).

Мета дезагрегации полягає в отриманні з високим виходом суспензії інтактнихізолірованних клітин або ядер, досить добре відповідної ісходномуобразцу тканини. Вибір способу дезагрегации залежить від типу тканини, размеровпрепарата, цілей дослідження, а іноді від швидкості і вартості методу.

Суспендування архівних препаратів, залитих в парафін

Методика дослідження ДНК за допомогою проточної цитометрії суспензії ядер, отриманої іззаключенних в парафін архівних препаратів, була вперше описана в 1983 р (D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983). Цю методику можна використовувати в модифікованій формі дляаналізу найрізноманітніших пухлин. Це дає цілий ряд переваг:

- можна проводити великі ретроспективні клінічні дослідження -

- зазнає суттєвого спрощення вивчення рідко зустрічаються патологій -

- парафінові зрізи легко транспортувати, що дозволяє проводити цитометрические дослідження в спеціальних центрах.

Недоліки методу полягають в тому, що:

- якість одержуваних результатів, як правило, не дуже висока -

- не можна використовувати внутрішній ДНК-стандарт.

Якість результатів можна підвищити, якщо трохи вдосконалити фіксацію тканин (C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.O`Reily, 1990). Хороший ефект дає фіксація в формаліні прінейтральном рН при 4 С протягом ночі. Слід уникати нагрівання тканини (якщо тільки воно не є абсолютно необхідним при її обробці) або неоправданнодлітельной фіксації.

фарбування ДНК

При фарбуванні клітинної ДНК з метою подальшого визначення її змісту з допомогою проточної цитометрії слід враховувати:

- специфічність барвника стосовно ДНК

- його спектральні характеристики: інтенсивність флуоресценції і можливість її реєстрації наявними у продажу приладами -

- вартість і зручність в роботі (розчинність, стабільність і т.д.)

Цим вимогам відповідає цілий ряд флуорохромов. Детальний їх опис дано в роботу Waggoner A.S. (1990), Crissman H.A., Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). Впроточной цитометрії для фарбування ДНК частіше за інших флуорохромовіспользуется іодістий пропідій (ІП) навіть незважаючи на те, що він не строгоспеціфічен по відношенню до ДНК. За допомогою ІП можна фарбувати також двухцепочечную РНК. Спектральниехарактерістікі ІП дуже зручні для проточної цитометрії: для збудження флуоресценції використовується звичайний аргоновий лазер з робочої довжиною хвилі 488 нм, а максімумфлуоресценціі знаходиться поблизу 620 нм, що дозволяє паралельно іспользоватьфлуоресцеін при проведенні многопараметрических вимірювань.

Незалежно від барвника останній повинен перебувати з ДНК в стехіометріческіхсоотношеніях, тобто кількість пов`язаного з ДНК барвника має бути пропорціональносодержанію ДНК в клітині. Щоб барвником були зайняті всі доступні длясвязиванія місця, його слід брати в деякому надлишку.

Більшість флуоресціюючих барвників, що зв`язуються з ДНК, в тому числі і ІП, що не могутпроходіть через мембрани інтактних клітин. Щоб підвищити проніцаемостьмембран, клітини або фіксують спиртом, або обробляють детергентами.

Використання іншої ДНК в якості стандарту.

Зміст ДНК, якій відповідає один з піків на ДНК-гістограмі для ісследуемогопрепарата, можна оцінити, порівнявши цей пік з піком для іншої ДНК, зміст яких відомо. Так, порівняння лівого піка на рис. 1 з піком, які відповідають ДНК диплоїдних лімфоцитів периферичної крові людини, говорить про те, що ми маємо справу сдіплоіднимі клітинами. У доповіді Комітету з номенклатурі в аналітіческойцітометріі рекомендується використовувати лімфоцити як незавісімогостандарта ДНК. Відомі й інші випадки, коли стандартом служать ядерниеерітроціти НЕ ссавців, а інших тварин.

Якщо використовуються ядра, виділені з ув`язнених в парафін препаратів, тонезавісімие ДНК-стандарти застосовувати не можна. Це пов`язано з неодінаковимокрашіваніем ДНК в ядрах, виділених з різних парафінових блоків, вследствіеразлічій в процедурах фіксації і обробки тканин. Якщо на ДНК-гістограммахпрепаратов, укладених в парафін, спостерігається два G 1 - піку, то лівий з них умовно вважається відповідним диплоїдним клітинам (рис.1, Б). Це не заважає виявленню анеуплоїдних клітин, оскільки всі зразки містять внутрішній контроль - диплоїдні клітини (лімфоцити, ендотеліальні клітини і т. Д.). Але в результаті деякі зразки помилково класифікуються як «гіперплоідние», хоча на самомделе є «гіпоплоіднимі». Клінічна значимість такої неправільнойклассіфікаціі невідома, але в будь-якому випадку її ймовірність невелика.

5.Прімененіе цитометрії в молекулярної клінічній діагностиці.

На перших порах основним стимулом до розвитку проточній цитометрії послужіложеланіе автоматизувати цитологічні методи, що використовуються для діагнозазаболеваній, але більшість опублікованих до теперішнього часу робіт посвященопрімененію цього методу для прогностичних цілей. Інтенсивне развітіеавтоматізірованних діагностичних систем скануючого і проточного типів способствовалобистрейшему впровадження цитометричного методу дослідження в клініческуюпрактіку. У процесі розвитку та освоєння методу відбувається його спеціалізація потремо провідних напрямів. Перше - це масові профілактичні осмотринаселенія з метою виявлення ранніх стадій захворювання, друге диференціальне діагностика прикордонних станів і злоякісного росту, третє - контроль динаміки пухлинного захворювання в ході проведеніялекарственной, променевої і комбінованої терапії, а також хірургічного методалеченія. Особливо плідно ведуться цитометрические дослідження в областігематологіі, гінекології, урології, пульмонології, гастроентерології, методтакже використовується для діагностики патологічних процесів молочної іщітовідной залоз.

З історії кількісної цитометрії відомо, що одним з перших об`ектовізученія були формені елементи крові і епітеліальні клітини слизовоїоболонки шийки матки. Дана обставина пов`язана з доступністю полученіядіагностіческого матеріалу, різноманітністю клітинних елементів, характерізующіхнормальное фізіологічний стан досліджуваних об`єктів, а також з трудностьюморфологіческой ідентифікації їх при різних патологічних процесах, особливо онкологічних захворюваннях.

гінекологія

Чималий досвід застосування кількісної цитометрії в області гінекології дає можливість окреслити кілька етапів у розвитку кількісного методу оцінки морфологічних особенностейепітеліальних клітин шийки матки. Перший етап характеризується дослідженнями, вкоторих розглядається можливість здійснення цітоскрінінга, т.е.разграніченіе патологічних процесів на дві групи «норма - рак». Другий етапсвязан з диференціацією прикордонних станів шийки матки з аналізу одного, двох критеріїв діагностики з наступним застосуванням кореляційного аналізу, побудовою двох- і трипараметричної діаграм залежностей ізучаемихпрізнаков. Третій етап досліджень спрямований на поглиблену ідентіфікаціюклеток з вивченням їх структурних особливостей (інтегральна оптіческаяплотность, зміст ДНК), що відображають певні стани шийки матки прідіспластіческіх, метапластических процесах, внутрішньоепітеліальне і інвазивних формах раку. Полученниерезультати можуть послужити основою вивчення механізмів перестройкіепітеліального пласта в процесі його виникнення злоякісної пухлини і визначення пріродизлокачественной трансформації клітини. Характеризуючи даний напрямок, можноподчеркнуть значимість цитометричних досліджень і в області осуществленіяконтроля якості цитологічної та гістологічної діагностики заболеванійшейкі матки, а також оцінки ступеня репарації тканини в процесі лікування. Виходячи з фундаментальних досліджень, присвячених оцінці більш ніж 196 качественнихі кількісних ознак ядра і клітини і загального фону препарату, визначають, що найбільш значимі параметри, що характеризують морфологічні особливості ядра (Б.М.Брамберга, І.Я.Зітаре, Д.П.Плегере, Е.Х.Смілтніекс, 1970). Тому пріколічественном аналізі препаратів зазвичай походять від інформативності розмірних іструктурних характеристик ядра: вивчають його площа, периметр, обсяг, діаметр, визначають коефіцієнт форми іоптіческую щільність, зміст ДНК, РНК і білка в ньому. На підставі даннихпроточной цитометрії встановлено, що серед обстежуваних пацієнтів з разлічнойпатологіей шийки матки в 74,5% випадків є конділоматозного ізмененія.Установлен профіль типовою ДНК-гістограми для даної патології шийки матки зверхньо вмістом ДНК в G 0 / G1-фазі і ранньої S-фазі клітинного циклу. Вважають, що спостерігаються зміни ВДНК-гістограмі можна розглядати як прояв папіломи-вірусну інфекцію етіології кондиломи шийки матки (K. C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984).

кровотворна система

При цитометричного аналізі клітинних елементів крові використовують критерії, коториевключают досить широкий спектр параметрів. Це в першу очередьцітометріческіе маркери з використанням специфічних барвників на РНК, ДНК, різних ферментативних систем (естеразу, фосфатазу). Використовуються такжеразмерние критерії, які включають обсяг, площа, периметр і діаметр ядра іцітоплазми клітин, а також ядерно-цитоплазматическое відношення.

При дослідженні діагностичного матеріалу при гострих і хронічних формахлейкозов методами цитометрії виявлені деякі відмінності для клеточнихелементов тієї чи іншої групи гемобластозів. Використовуючи морфометрические методиоценкі розмірних ознак ядра і цитоплазми бластних клітин, обнаруженастрогая кореляція величини клітин та FAB (франко-американо-британської) - класифікації лейкозів. При зіставленні кількісних даних, отриманих при дослідженні клеточнихелементов при гострих лімфобластний і мієлобластний лейкозу, классіфіціруемихпо морфологічними ознаками на підгрупи М 1 - М 6согласно FAB- класифікації, визначені відмінності між двома варіантами лейкозів, крім підгрупи М2 .Регістріруемие відмінності в розмірі бластних клітин пов`язані з фазами клеточногоцікла. Встановлено, що клітини при гострому мієлобластний лейкоз в S -фазі циклу характеризуються великим розміром ядра. Для цієї ж формі лейкозу, але підгрупи М 1характерна менша частка клітин в S -фазі клітинного циклу (M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981).

Молочна залоза

З метою підвищення діагностичних можливостей цитологічного методу при добро-і злоякісних пухлинах молочної залози, визначення їх гістологіческіхваріантов, розробки прогностичних критеріїв захворювання - такжеіспользуются дані морфометрії і цитоспектрофотометрії. При об`ектівізацііцітологіческіх препаратів виходячи з інформативності наступних ознак: діаметр, периметр і площа ядра і цитоплазми, ядерно-цитоплазматическое ставлення, текстура хроматину, зміст ДНК і РНК. На підставі цитометричних досліджень установленинекоторие закономірності, характерні для злоякісних форм опухолеймолочной залози. Це варіабельність ядерно-цитоплазматичного співвідношення, наростання розміру ядра і змісту ДНК. Між двома останніми показателяміобнаружена кореляційний залежність, що характеризується следующіміособенностямі. Показано, що клітини з деякою атипией, яка виражається вувеліченіі площі ядра, розподіляються по-різному по фазах клітинного цікла.Около 21% клітин, що знаходяться в області 4с ДНК-гістограми, мають площу ядерсвише 125 мкм². При площі ядер від 50 до 100 мкм²основна маса клітин знаходиться в G1 -фазі циклу і тільки близько 5% клітин припадають на гіпердіплоідную область розподілу ДНК (C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985). Показник ДНК (кількість ДНК в 1 клітці пухлини на кількість ДНК внормальной клітці) в різних типах злоякісних пухлин молочної железизначітельно варіює, проте частіше спостерігається тетраплоидия (60 - 80%), доброякісні пухлини, як правило, диплоїдні. Порівняльна оценкасодержанія ДНК в клітинах молочної залози при доброякісних і раковихпроцессах показала певну залежність між співвідношенням клітин по фазамцікла. Встановлено, що з прогресуванням процесу кількість діплоіднихклеток в G1 -фазі циклу убуває і при III - IV стадії ракового процесу становить 64%. Кількість тетраплоідних клітин наростає в 2 рази і становить близько 17% загальної кількості клітин в порівнянні спроліфератівной формою мастопатії і в 3 рази по відношенню до непроліфератівнойформе мастопатії.

ВИСНОВОК

Таким чином, як проточна, так і статична цитометрия дозволяє досліджувати багато важливих параметрів клітинного циклу. Найбільш поширеною завданням, розв`язуваної за допомогою даного класу приладів, є ідентифікація і подсчетклеток, що знаходяться в різних періодах клітинного циклу. Останнім времяпараллельно з цими параметрами за допомогою цитометров досліджують також динаміку експресії багатьох важливих клітинних маркерів, що може мати діагностичне і прогностичне значення. Важноотметіть, що принципових відмінностей між двома типами цитометрии, очевидно, не існує. Тому за допомогою досить простих і недорогіхпріборов можна відтворювати дуже ефективні методики ісследованіяклеточного циклу, спочатку розроблені для дорогих проточнихцітометров. Такі системи статичної цитометрії включають в себе люмінесцентниймікроскоп, чорно-білий або кольоровий телевізійну камеру високойчувствітельності, пристрій для оцифровки телесигналу і комп`ютер. У последнеевремя в подібних системах все більш широко застосовуються цифрові телекамери, які підключаються до комп`ютера через високопродуктивні порти новогопоколенія (універсальний послідовний порт). Це дозволяє создаватьнедорогіе і досить потужні системи для статичної цитометрії, які могутуспешно конкурувати як з проточної цитометрії, так з конфокальнимімікроскопамі. В цілому можна зробити висновок про перспективність даного направленіяв цитології, що дає можливість широкого застосування методів колічественноймікроскопіі в наукових дослідженнях та клінічній практиці.

ЛІТЕРАТУРА

1. Брамберг Б.М., Зітаре І.Я., Плегере Д.П., Смілтніекс Е.Х. Термінологічний словник морфологічних ознак клітини для автоматизації цитологічної діагностики іоценкі ефективності лікування. - Рига, 1970. - 160 с.

2. Введення в кількісну цитохімія. М., Мир, 1969, 439с.

3. Ісаєв В.Л., Пінчук В.Г., Ісаєва Л.М. Сучасні методи автоматизованих цитологічних досліджень. - Київ: Наук. думка, 1988. - 218 с.

4. Лімфоцити. Методи / під пед. Дж. Клауса-М., Мир, 393с.

5. Молекулярна клінічна діагностика. Методи / під ред. С.Херрінгтона, Дж.Макгі. - М .: Світ, 1999. - 558с.

6. Полєтаєв А.І. Проточна цитометрії та сортування в цитології, молекулярної біології, біотехнології та медицині. М., ВІНІТІ, 1989, 87с.

7. Baisch H., Gohde W., Linden W.A. (1975). Radiat. Environ. Biophis., 12, 31.

8. Blair O.C. Winward R.T., Roti J.L. The effect of hyperthermia on the protein content of Hela cell nuclei: A flow cytometric analysis // Radiat. Ress - 1979. - 78. - P. 474

9. Cornelisse C.J., Van Driel-Kulker A.J., Meyer F., Ploem J.S. Automated recognition of atypical nuclei in breast cancer cytology specimens by iterative image transformation // J. Microsc. (Gr.Brit.). - 1985. - 137, N 1. - P. 101 - 110.

10. Crissman H. A., Steinkamp J.A. (1990). ). In: Flow cytometry and sorting (2^nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 227 - 247. Wiley - Liss, New York.

11. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M.R. New cell cycle compartments identified by multiparameter flow cytometry // Cytometry. - 1980. - 1, N 1. - P.98.

12. Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. - XIII, Excerpta Medica. - 1981. - P. 224 - 228.

13. Enchev V.G., Tsanev K.G. Comparative cytomorphometric and cytospectrophotometric investigations of gastric lesions // Ibid. - 1985. - 55, N 1. - P. 37 - 46.

14. Gillett C.E., Camplejohn R.S., O`Reily S.M. (1990). J. Pathol., 160, 173A.

15. Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A., Musgrove E.A. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31, 1333.

16. HoddemanW., Schumann J., Andreeff M., Barlogie B., Herman C.J., Lief R.C. et. Al. (1984). Cytometry, 5, 445.

17. Jacobberger J.W., Sramkoski R.M., Wormsley S.B., Bolton W.E. Estimation of kinetic cell-cycle-related gene expression in G1 and G2 phases from immunofluorescence flow cytometry data / Cytometry, 1999,35, 284-289.

18. Laff S.A., Langolis R.J. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2^nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp.249 - 290. Wiley - Liss, New York.

19. Lalande M., Schreck R.R., Hoffman R., Latt S.A. Identification of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate flow cytometric analysis // Cytometry. - 1985. - 6, N 1. - P. 1 - 6.

20. Muller E., Weidhase R. Impulscytophotometrische Untersuchungen zum DNS-Gehalt in Humanen Zellkernen // Wiss. Beitr. M. - Luther-Univ. Halle-Wittenberg. - 1983. - 32, N 2. - S. 3 - 8.

21. Ormerod M.G. (Ed.) (1990). Flow cytometry- A practical approach. IRL Press, Oxford.

22. Pollack A., Moulis H., Block N.L., Irvin G.L. Quantitation of Cell Kinetic Responses Using Simultaneous Flow Cytometric Measurements of DNA and Nuclear Protein // Cytometry. - 1984. - 5, N 5. - P. 473- 481.

23. Steinkamp J.A. Flow cytometry // Rev. Sci. Instrum. - 1984. - 55, N 9. - P. 1375 - 1400.

24. Tsou K.C., Hong D.H., Varello M. et. al. Flow cytometric DNA analysis as a diagnostic aid for cervical condyloma and cancer // Cancer. - 1984. - 54, N 9. - P. 1778 - +1787.

25. Van Dilla M.A., Trujillo T.T., Mullaney P.F., CoulterJ.R. (1969). Science, 163, 1213.

26. Vindelov L.L., Christensen I.J. (1990). Cytometry, 11, 753.

27. Waggoner A.S. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2^nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 209 - 225. Wiley - Liss, New York.