Інфекційний ларинготрахеїт птахів

Відео: діагностика хвороби курей. рада для початківців

інфекційний ларинготрахеїт птахів (ІЛТ) Infectiose Laryngotracheitis des Huhnes (нім.), Infections laryngotracheitis (aнг.), Laryngotracheite infectieuse (франц.) - це вірусна контагіозаная респіраторна хвороба вражає курей, індичок, фазанів Вперше описаний в 1925 р Мей і Тітслер під назвою інфекційний бронхіт З 1931р її стали називати інфекційним ларинготрахеїтом. Реєструється у всіх країнах світу, де розвинене промислове птахівництво.

Відомості про збудника. Вірус вперше виділив Бічь в 1930 р в США

Морфологія і хімічний склад. Геном вірусу ІЛТ має довжину 155 тис пні складається з довгою унікальною послідовності 1Д (120 тис пн) і короткою унікальною послідовності Us (17 тис п н). Глікопротеїни вірусу ІЛТ були виділені з екстрактів вірусінфіцірованних клітин і очищені за допомогою лектин-афінної хроматографії глікопротеїни охороняли 83% птахів від зараження їх патогенним вірусом. Глікопротеїн В (gB) є першим структурним білком вірусу ІЛТ птахів Клоновано, секвенирован ген цього білка.

Стійкість. Вірус чутливий до липолитическим агентам, тепла і різним де-зінфектантам Він довго зберігає свою активність вліофілізірованном стані або при - 20-60 ° С Температура 55 ° С руйнує вірус протягом 10-15 хв, а 38 ° С - за 48 год В віруссодержащей трахеальной слизу хворого курчати вірус руйнується протягом 44 год при температурі 37 ° С, а в ХАО при 25 ° С протягом 5 год в патологічному матеріалі (трахеї від хворих курей) при температурі - 8-10 ° С він зберігався більше 370 дн в заморожених тушках хворих і змушене убитих курей, що зберігалися при температурі - 1 0, 18, 28 ° С, вірус залишався активним понад 19 міс, на поверхні шкаралупи в умовах термостатаін активується через 12 год, а в заражених пташниках зберігається не більше 9 дн Повністю інактивується в 1% -ому розчині креола протягом 30 з%

АГ варіабельність і спорідненість. Всі пташині герпесвіруси на підставі перехресної РН згруповані в 11 різних груп. Штами вірусу ІЛТ розрізняються по вірулентності для птахів і КЕ, тропізму, швидкості виділення з клітин в тканинної культурі, стійкості при зберіганні, авідності, молекулярно-структурними особливостями імунологічних відмінностей серед штамів вірусу ларинготрахеїту не виявлено, хоча деякі відхилення в здатності нейтралізуватися гіперімунні сироватками описані у штамів різної вірулентності.

Локалізація вірусу. Вірус виявляють головним чином вдихательних шляхах, в меншій кількості в печінці і селезінці. При інтратрахеально зараженні 30 денних курчат його виділяли з трахеї і носових ходів 7 дн, при ректальному зараженні знаходили в фабріціевой сумці і трахеї протягом 3 днів. У птахів-реконвалесцентів встановлено тривалий вірусоносійство. З трахеї перехворіли птахів вірус виділяли 2 дня. Послеострой фази ІЛТ може наступити латентний період зі збереженням генетичного матеріалу вірусу в ДНК клітин ганглія трійчастого нерва. При різних впливах може статися реактивация інфекції з виділенням вірусу в зовнішнє середовище.

АГ активність. ВНА у заражених курей з`являються з 2-3 тижні після зараження, титр їх досягає максимуму до 5-го дня і зберігається до 8-21 місяців.

Експериментальна інфекція. Заразити сприйнятливу птицю легко шляхом аплікації віруссодержащего матеріалу на слизову оболонку гортані, трахеї, очей, носа, подглазничного синуса і клоаки. На 6-12 дн у заражених курчат розвиваються типові симптоми хвороби. На 3-10 дн після всередині трахеальной інокуляції вірусу у курей-несучок відзначаються ознаки помірного респіраторного захворювання. На 4-й дн в тканини трахеї і носової порожнини виявляється вірус. У період між 19 і 59 дн після зараження за допомогою ЦПР періодично виявляється вірус. Ганглії трійчастого нерва є основним місцем локалізації вірусу. У експериментально заражених СПФ-курчат вакцинним шт. SA-2 вірусу ІЛТ вірусний АГ в трахеальні змивах визначався до 7-го дн після зараження, a AT проти вірусу в трахеальні змивах з 5-го дн після зараження. Імуноглобуліни класу А з`являлися на 6-й день після зараження, а ВНА - тільки на 14 день. Вірус викликав захворювання у індичок у віці 3-4 тижнів і 2-10 міс. Хворі індички можуть бути джерелом зараження курей. Дані про сприйнятливості голубів до вірусу суперечливі Павичі і фазани виявилися чутливими до вірусу, причому чутливість фазанів була вище Кролики, морські свинки і білі щури резистентні.

Вірусовиделеніе. В експериментальних умовах інфіковані птахи починають екскретуватися вірус через 8 днів після зараження Предінфекціонний період може тривати 2 дні, а виділення вірусу спостерігалося протягом 6 днів. Клінічні ознаки у зараженої птиці зазвичай з`являються на 6 днів. В організмі перехворілих птахів вірус ІЛТ, як і багато інших герпесвіруси, може перебувати в латентній формі. Польові штами, як і вакцинні мають властивість персистувати в нервовій системі. Вакцинний вірус легко передається горизонтально. Тому при застосуванні вакцини краще імунізувати всіх курчат птахоферми.

Культивування. Вірус культивується на ХАО ембріонів курей, качок, індиків, деяких первинних і перещеплюваних культурах клітин, що не розвивається в ембріонах голубів і морських птахів. На ХАО утворюються фокусні ураження 2 типів крупноузелковие з непрозорою білою периферією інекротіческім центром і мелкоузелковие - без некрозу. Вузлові поразки з`являються на всій поверхні ХАО, а вогнищеві тільки на місці інокуляціівіруса. У заражених клітинах ХАО утворюються внутрішньоядерні включення, а іноді гігантські клітини. У культурах ліній СНЕВ, FJ, клітин фібробластів курячих ембріонів, нирки курчат, каченят, ембріонів свині, новонароджених кроленят вірус викликає до 3-4 дн ЦПИ, що характеризуються округленням і зернистістю клітин, лизисом їх з наступним відторгненням. У клітинах СНЕВ формуються цитоплазматичні включення і утворюються багатоядерні клітини. Внутрішньоклітинні включення виявляються через 12 год і до 30-36 год після зараження досягають найвищої концентрації. В інфікованих культурах клітин вірус викликає утворення бляшок.

ГА властивості. Вірус, репродукований в КЕ, не володіє ГА активністю Вона проявляється іноді в разі культивування вірусу в первинній культурі нирки курчат.

епізоотологічне характеристика. Джерела і шляхи передачі інфекції. Джерело інфекції -Хворий та перехворіла ІЛТ птах, яка тривалий час (понад 2 роки) залишається вірусоносієм. Вірус від хворих птахів можна виділити протягом 7 днів після появи симптомів хвороби, після чого окремі перехворіли птахи залишаються вірусоносіями і періодично виділяють вірус, не обов`язково при цьому з переходом хвороби в клінічну форму. Інфікування може відбуватися і статевим шляхом. Можлива передача вірусу через заражену шкаралупу яйця. В умовах інкубатора вірус зберігає інфекційність до 96 годин. Після обробки яєць парами формальдегіду він гине через 40 хвилин. Після гострої фази інфекції може настати латентний період зі збереженням генетичного матеріалу вірусу в ДНК клітин ганглія трійчастого нерва. При різних впливах може статися реактивация інфекції з виділенням вірусу в зовнішнє середовище. Сприятливим фактором в плані викорінення інфекції в птахівничих господарствах є високий ступінь видоспецифічності вірусу, необхідність тісного контакту курей для поширення інфекції, швидка інактивація вірусу поза організмом птахів, генетична стабільність вірусу, відсутність розмноження вірусу в трахеї при наявності місцевого специфічного клітинно-опосередкованого імунітету.

Спектр патогенності в природних умовах. У природних умовах вірус вражає курей різного віку Фазани та індички також чутливі до вірусу ІЛТ

Клінічні ознаки і патологоанатомічні зміни.Інкубаційний період коливається від 2 до 30 днів. Тривалість його залежить від вірулентності, дози вірусу, методу введення в організм і фізіологічного стану птиці. Найбільш короткий інкубаційний період, рівний 40 ч, відзначений при інтратрахеально зараженні. Хвороба протікає сверхостро, гостро і хронічно. Розрізняють легку і атипову форми хвороби, а по локалізації уражень -ларінготрахеальную і кон`юнктивальну форми. Перша зазвичай протікає гостро і супроводжується кашлем, задухою, хрипом при диханні. Катаральне або фібринозне запалення слизових оболонок можна спостерігати в носовій порожнині іінфраорбітальних синусах Слизова оболонка в цих випадках гіперемована набрякла, іноді пронизана дрібними крапковими крововиливами. У ротовій полостіна слизовій оболонці можна знаходити легко відокремлюються нальоти білуватого кольору локалізуються біля кореня язика, в кутах дзьоба, окружності неба і біля входу в гортань і глотку У ряді випадків відзначають катаральний фарингіт На розтині зміни знаходять головним чином в гортані і трахеї. В просвіті гортані виявляють казеозную пробку. Після її видалення слизова оболонка гортанінеровная, червона, набрякла, потовщена. Кон`юнктивальна форма частіше спостерігається у курчат і характеризується катаральним або фібринозним кон`юнктивітом. Ця форма може протікати тільки з ураженням кон`юнктиви або в поєднанні з ларінготрахеальной формою хвороби У частині птахів відзначають набряк повік, особливо нижнього У деяких курей і курчат розвивається фібринозне запалення кон`юнктиви з відкладенням в кон`юнктивальний мішок фібринозно-казеозних мас склеюванням століття, помутнінням рогівки, іноді з розвитком панофтальмита. Зміни в легенях при ІЛТ знаходять зазвичай у невеликої кількості птахів. У деяких випадках вони обмежуються тільки бронхами, в яких розвивається катаральне, рідше фібринозне запалення, іноді в просвіті бронхів виявляють згустки крові або фібринозно-казеозние пробки.

Найхарактерніші ознаки ІЛТ відзначаються у курчат-бройлерів у віці 4-7 тижнів і у курей-несучок у віці 18-76 тижнів. У ряді випадку водно тимчасово з бронхітом виявляють катаральну пневмонію у вигляді невеликих сіруватих ущільнених ділянок, іноді з дрібними вогнищами некрозу жовтуватого кольору Поразка повітроносних мішків зустрічається порівняно рідко Однак при експериментальному відтворенні інфекції, особливо при інтратрахеально методі зараження, аеросаккуліт часто знаходять у значної кількості птахів. Стінка повітроносних мішків при очаговом або дифузному ураженні потовщена, частково або повністю непрозорі судини її переповнені кров`ю. У порожнині повітроносних мішків знаходять серозний пінистий ексудат зі згустками фібрінаілі зернами фібринозно-казеозних мас В епітеліальних клітинах трахеї вже через 12год після зараження знаходять внутрішньоядерні включення типу А. При звичайному фарбуванні вони представляються однорідними, а при сріблення виявляються аргінінофільние гранули.

При ларінготрахеальной формі хвороби характерні зміни відзначають в гортані і трахеї. Слизова оболонка цих органів гіперемована, набрякла, ерозовані, з крововиливами, а просвіт їх часто буває заповнений катаральним або катарально-геморагічним ексудатом. У більшості випадків в гортані знаходять фібринозно-казеозних мас, що закупорюють просвіт. При деяких Ензоотія виявляють катаральне запалення слизових оболочекносовой і ротової порожнин, а на корені і вуздечці мови фібринозні наложенія.У деяких курей спостерігають збільшення селезінки, катаральне запалення тонкого кишечника, фабріціевой сумки і клоаки. У бронхах і легенях ураження зустрічаються рідко, в вигляді катаральної бронхопневмонії. При кон`юктівальний формі відзначають серозний або фібринозний кон`юнктивіт з відкладенням в кон`юнктивальний мешокказеозних мас, помутніння рогівки і поразка очного яблука.

гістологічні зміни. Відповідають картині розтину. У гортані і трахеї знаходять серозно-катаральне або фібринозно-геморагічне запалення слизової оболонки. На початку хвороби виявляють гіперемію судин, дистрофію покривного епітелію і набряк слизової оболонки, в більш пізні терміни некроз і десквамація респіраторного епітелію, інфільтрацію слизової оболонки або мфоідно-гістіоцитарні елементами і пе-ріваскуяярние крововиливи. В окремих ділянках слизова буває некротизована до хрящового кільця. Вірус розмножується в епітеліальних клітинах слизової оболонки гортані, трахеї, кон`юнктиви, легких, повітроносних мішків, клоаки і народу з запальною реакцією утворює внутрішньоядерні включення. Включення виявляють до настання некрозу епітелію між 1-5-м дн після зараження. Форма їх округла, овальна або довгаста, кількість в одрі 1-4, оточені світлим обідком. Описано спонтанне масове некротичне ураження тимуса, фабріціевой сумки і селезінки у 40-дн курчат-бройлерів з ознаками анемії. При розтині виявлено зменшення розміру тимуса і фабріціевой сумки, які мали темно-жовтий або коричневий колір, відзначалася також дифузна аденоектазія залозистого желудка.Прі гістологічному дослідженні спостерігали осередки фибрино-гнійного запалення інекроза в тимусі, фабріціевой сумці і селезінці В гістіоцитах і лімфоцитах цих органів виявлені поодинокі великі внутрішньоядерні тільця-включення. За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії в набряклих ядрах з периферичних розташуванням хроматину гистиоцитов тимуса зафіксовано наявність герпесвірусних частинок. При гострому перебігу хвороби вірус ІЛТ в 85-86% випадків виявляли в інфікованих клітинах трахеї і гортані, в 80-88% - в інфікованих клітинах великих бронхів і лише в 60 - 62% - в інфікованих клітинах дрібних бронхів і бронхіол. Вірус ІЛТ в 76-84% випадків вдається виділити з змивів носоглотки, гортані і трахеї. При підгострому і хронічному течіях позитивні результатиполучалі при дослідженні інфікованих клітин гортані і трахеї (96%), бронхів і бронхіол (85%), змивів носоглотки, гортані, трахеї (72-86%), шлунково-кишкового тракту (до 60%) і печінки (8 -12%). Таким чином при хронічному перебігу хвороби позитивні результати по виділенню вірусу ІЛТ вище, ніж при його гострому перебігу, виключаючи печінку. Тим самим діагностична надійність методу вірусовиделеніе при дослідженні органів птахів з різним ступенем вираженості патологічних змін становить від 85% (при гострому перебігу) до 96% (пріподостром і хронічному перебігу захворювання). Однак метод вірусовиделеніе, володіючи високою специфічністю має істотний недолік - значна тривалість у часі (до 45-52 днів).

Патогенез. Вірус проникає в організм через кон`юнктиву, носову або ротову порожнини і репродукується в епітеліальних клітинах слизової оболонки гортані і трахеї, викликаючи серозно-катаральне запалення і утворення внутрішньоядерних включень. Впораженних епітеліальних клітинах відбувається швидке розмноження ядер безделенія цитоплазми. Через 24 год з місць ураження вірус надходить в кровоносну систему. На цій стадії захворювання виявляють дистрофію, некроз і десквамацію епітелію слизової оболонки респіраторного тракту, а в просвіті трахеї слизової ексудат з домішкою крові. При подальшому перебігу хвороби ураження слизової гортані і трахеї посилюються не тільки самим дією вірусу, але і в результаті відбуваються в ній дистрофічних ізмененій.Отмечают звуження просвіту дихальних шляхів, а часто і освіту казеозних пробок, що призводить до повної їх закупорки і птах гине від асфіксії .

діагноз ставлять на підставі епізоотологічних даних, клінічних ознак хвороби, і результатів лабораторних досліджень. Часто хвороба протікає атиповий, характерні ознаки її слабо виражені або їх немає. У таких випадках вирішальне значення в діагностиці набувають лабораторні методи дослідження.

Виділення вірусу. Взяття і підготовка матеріалу. Для вірусологічного дослідження від хворих птахів беруть ексудат з трахеї, що відпали або вимушено убитих в початковій фазі хвороби між 2-7 дн - слизові оболонки гортані, трахеї, кон`юнктиви, носових ходів і шматочки легенів. Матеріал заморожують і зберігають при - 20 ° С і нижче. Для гістологічних досліджень матеріал поміщають в 10% -ний розчин нейтрального формаліну. З патологічного матеріалу готують суспензію 1 5 на розчині Хенкса або фізіологічному розчині NaС1, центрифугують при 1500-2000 хв 1 протягом 15хв, до надосадової рідини додають по 1000 ОД пеніциліну і 500 мкг стрептоміцину в розрахунку на 1 мл витримують протягом 3-8 год при 2-4 ° С. Затеміспользуют для інокуляції КЕ, культури клітин або НЕ імунної до ІЛТ курчат

Зараження КЕ. Для кожної проби використовують по 10 ембріонів в9-12 та віку. Заражають на ХАО Загиблих в перші 24 години після інокуляції ембріонів не враховують Тих, хто залишився живих ембріонів на 6-8-й дн убівают.Макроскопіческіе зміни ХАО з`являються через 2,5-3 добу і досягають максимуму до 5-6 дн. Штами вірусу ІЛТ викликають мелкоузелковие і вогнищеві ураження ХАО. Вузлові поразки виявляються по всій поверхні ХАО, вогнищеві - тільки на місці інокуляції вірусу. Необхідно враховувати, що не всі штами викликають загибель курячих ембріонів на 4-6- дн. Для виявлення специфічних поразок треба провести не менше 3 пасажів, використовуючи ХАО, суспендованих в аллантоісной рідини попереднього пасажу.

Виділення вірусу треба підтвердити виявленням тілець-включень Зейфрід, РН, РДП, біопроб, а також ІФ і ЕМ.

Зараження культур клітин. Найбільш придатні в даному випадку культури клітин нирок ембріона і курчат, в яких перші зміни спостерігаються іноді вже через 24 годин після зараження, а через 48-72 год в клітинній культурі виявляються багатоядерні гігантські клітини, в яких можна виявити внутрішньоядерні включення. Специфічність цих змін доводять ІФ або РН. Спостереження за культурою клітин проводять до 6-7 дн Для первинного виділення вірусу так само придатні клітини Vero

Індикація та ідентифікація вірусу

Виявлення специфічних тілець-включень. Вірус ІЛТ розмножується в епітеліальних клітинах слизової оболонки гортані, трахеї, клоаки, викликаючи гостре запалення цих оболонок з утворенням внутрішньоядерних включень. Включення виявляються до настання некрозу епітелію між 1-м і 5-м дн після интратрахеального зараження курчат. В мазках з кон`юнктиви включення знаходять через 48 годин після зараження. Ядро, що містить включення, зазвичай збільшено, відзначається гіперхроматія ядерної оболонки. Включення мають округлу форму, іноді форму диплококков і займають 1/2 -1/3 клітинного ядра.Вокруг включення видно неокрашенная зона, що вважається характерним. Хворобу можна діагностувати на підставі виявлення всередині ядерних включень. Для цього на предметних стеклах готують мазки з соскобов епітелію слизової оболонки, фіксують в абсолютному метиловий спирт протягом 3-5 хв забарвлюють розчином фарби Гімза (1капля фарби на 1 мл дистильованої води) протягом 2 год при 37 ° С, потім мазки промивають, обробляють абсолютним метиловим спиртом, знову промивають, висушують і переглядають. В позитивних випадках цитоплазма епітеліальних клітин забарвлюється в блідо-блакитний колір, ядерні оболонки таких клітин темніші, внутрішньоядерні включення чітко видно, світло червоного кольору, за формою варіюють (кулясті або колбасовідние), оточені ясно видимими світлими ободками. Кількість їх в ядрі від 1 до 4.Указанний метод дозволяє іноді протягом 3-4 ч діагностувати ІЛТ навіть при атиповому прояві. Ймовірність виявлення тілець-включень в патологічному матеріалі існує тільки в початковій фазі хвороби - між 2-7 дн.

ІФ. Дозволяє виявити вірусний АГ за допомогою специфічної флюоресцирующей сироватки в мазках зі слизової оболонки трахеї, кон`юнктиви від хворих курчат (в період гострого перебігу хвороби), з ураженої ХАО і інфікованих культур клітин. Реакцію ставлять за загальноприйнятою методіке.Чаще використовують прямий метод. Позитивну ІФ в мазках від хворої птиці спостерігають в період гострого перебігу хвороби, коли виявляються внутрішньоядерні включення і можна виділити вірус на КЕ.

Біопроба. Ставлять її на курчатах 30-90- дн віку шляхом аплікації віруссодержащего матеріалу на слизову оболонку гортані, трахеї, очей, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наявності вірусу в досліджуваному матеріалі у заражених курчат на 6-12 днів розвиваються типові клінічні ознаки експериментальної інфекції. При інокуляції матеріалу в подглазнічний синус в позитивних випадках розвивається синусит з набряком, виділеннями з носових ходів і сльозотечею. Позитивна реакція на клоачного пробу проявляється з 3-го по 8-й дн, але частіше на 4-5 дн в вигляді набряклості слизової оболонки - фабріціевой сумки і катарального, геморагічного або фібринозного запалення.

Спостереження за зараженими курчатами ведуть до 14 днів. Найчастіше зараження проводять на слизову оболонку трахеї і клоаки, так як цей метод дозволяє визначити вірулентність штаму, а також провести диференціацію від вірусів, що викликають подібне ураження ХАО у інфікованих КЕ. При інтратрахеально зараженні 4-тижнів курчат вірулентним штамом CS-1 вірусу ІЛТ. Найбільший титр вірусу в тканинах трахеї (106 БОЮ / г) встановлено на 2-4-е добу. Пізніше кількість вірусу різко знижувався і на 7 днів його не виявляється, хоча антиген вірусу в епітелії трахеї і у великій кількості виявляли ще на7-8 добу за допомогою ІФ.

Останнім часом природні інфекції все частіше протікають нетипово, абортивно, хронічно або навіть безсимптомно. Кошти, виділені штами також менш патогенні для КЕ, не завжди призводять до їх загибелі і навіть не завжди викликають патологічні зміни на слизових оболонках при безпосередньому віданні досліджуваного матеріалу.

РН. Реакцію ставлять за загальноприйнятою методикою. Найчастіше в діагностичній практиці використовують метод: - розведення вірусу і постійна доза сироватки. Результати РН висловлюють в індексах нейтралізації. Прийнято індекси нейтралізації від 1 до 9 вважати негативними, від 10 до 49 сумнівна, від 50 і вище - позитивними. РН можна проводити і в культурі клітин ПЕК і 3-8 дн курчатах.

РДП. Для ідентифікації збудника в РДП використовують набір курячих антисироваток, отриманих до різних вірусів птахів. РДП ставлять за загальноприйнятою методикою. Для РДП при діагностиці ІЛТ птахів 1,5% -ний агаровий гельготовят на верональном буферном розчині з рН 7,2 в такий спосіб: в 100 мл гарячої дистильованої води розчиняють 1,84 г вероналу, після охолодження доливають дистильованою водою до 1000 мл і розчиняють в отриманому розчині 10,3 г мединал. Розчин зберігають при 4 ° С. Реакція проста по техніці виконання і дозволяє виявляти приблизно 75% позитивних випадків, встановлених за допомогою зараження ембріонів. РДП специфічна, але недостатньо чутлива, її використовують головним чином для ретроспективної діагностики серед дорослих курей.

Приготування гіперімунна сироваток і антігенов.Гіперіммунние вірус-нейтралізуючі сироватки отримують на кроликах за наступною схемою. Вірус (суспензії ХАО 1:10 після центрифугування при 2500 хв 1 протягом 30 хв) вводять кроликам внутрішньовенно протягом 3 тижнів по 3 рази на тиждень (через 1 дн): в першу тижнів - по 2 мл, у другу - по 3, в третю - по 4 мл.Через 7 тижнів після первинної імунізації кролику внутрибрюшинно ін`єктують 10 мл вірусу, а на наступний день - 15 мл внутрішньовенно. Через 7 днів після останнього введення АГ кроликів знекровлюють. Гіперімунні кролячі сироватки використовують в РН для типування вірусу ІЛТ.

Отримання гіперімунна преципитирующих сироваток на птаху. Центрифуговані суспензію віруссодержащей ХАО в розведенні 110 вводять дорослим півнів в подкрильцовой вену в обсязі 1-2 мл за схемою 4 ін`єкції з проміжками в 1 день, 7 днів відпочинку, 4 ін`єкції з проміжками в 1 день. На 6-йдн після останньої ін`єкції пробно беруть кров із серця, в разі неактивності сироватки проводять трикратне введення вірусу з добовими інтервалами, на 6-ий день вдруге беруть пробу крові. Встановлено що препарати очищеного вірусу ІЛТ, отримані в градієнті щільності гліцерин-тартрату, більш придатні для виділення віріонної ДНК, тоді як препарати, очищені в Перколь, краще використовувати в якості специфічного АГ для ІФА та отримання специфічних сироваток. За даними електронної мікроскопії препарати вірусу ІЛТ, очищені в Перколь, практично не містять домішок клітинних компонентів (везикул).

Ідентифікація вірусу за допомогою мон АТ. За чутливості ІФА з мон АТ можна порівняти з методом виділення вірусу, але більш швидким і більш чутливим у порівнянні з ІФ В ІФА використовують кролячі поліклональні AT і мишачі мон АТ.

Серодиагностика і ретроспективна діагностика. В нетипових випадках, особливо при хронічному перебігу інфекції, провести діагностику дозволяє встановлення зростання титру антитіл при дослідженні парних сивороток.Однако такого роду дослідження проводяться головним чином з метою отримання даних, які б свідчили про перенесення захворювання даної громадянами та вказують на ступінь поширеності збудника на певній території. Зразки сироватки від птиці досліджують двічі - через 14-28 днів інтервал. Підвищення титру антитіл до вірусу і числа позитивно реагують птахів в стаді свідчить про наявність і поширення інфекції в господарстві, а збереження або зниження рівня AT - про минулу інфекції. Для серологічного дослідження кров беруть на 14-28-й дн від початку хвороби не менше ніж від 5-10 птахів по 5 мл від кожної. До початку дослідження сироватку зберігають в замороженому стані при мінус 20-70 ° С. Сироватки хворих і перехворілих птахів, а також контрольні інактивують при 56 ° С 30 хв.

Приготування антигенів для РН і РДП. ХАО КЕ з характерними для даного вірусу ураженнями гомогенизируют з рівною кількістю буферного ізотонічного розчину з рН 7,2-7,4, до якого додані антибіотики з розрахунку по 100 ОД пеніциліну і стрептоміцину на 1 мл розчину. Суспензію Центрифугують при 3000 хв 1 20 хв. Треба садочної рідину зливають і використовують в якості антигену, якщо вона містить вірусу не менш 105 ЕІДзо / млАГ зберігають в замороженому стані. Запропоновано наступна методика концентрації і очищення вірусу віруссодержащего матеріал концентрують поліетиленгліколем з МОЛМІ 6000, кінцева концентрація його в вірусосодержащей суспензії повинна бути дорівнює 7% Концентрування ведуть при 4 ° С протягом 3 год, центрифугують концентрований вірус при 3000об / хв. 30 хв. Інфекційна активність отриманого вірусу - 1 О6-107 ЕІД 50 / мл

РН. Найбільш чутлива в порівнянні з РДП і РРІД. Вона виявляє специфічні AT у 96-98% інфікованих птахів незалежно від форми перебігу захворювання. Однак ця реакція трудомістка і вимагає значної кількості КЕ. На КЕ або культурах клітин реакцію ставлять за загальноприйнятою методикою, частіше використовують модифікацію постійна доза сироватки і різні розведення вірусу. Число рядів відповідає числу досліджуваних сироваток плюс 2 ряди контролю (з нормальною і імунної сироватками), а число пробірок в ряду число розведенні вірусу. Після контакту (1ч при кімнатній температурі) суміш сироватки з кожним розведенням вірусу інокуліруют не менше ніж 4 КЕ на ХАО по0,2 мл. Ембріони інкубують при 37 ° С протягом 6 днів. При розтині виявляють специфічні зміни на ХАО. В РН рекомендується використовувати не розведені сироватки. Оцінку результатів проводять за індексом нейтралізації. Сироватку з ІН10 або менше, вважають негативною, а з індексом більше 10 - позитивної.

РДП. Проводять за загальноприйнятою методикою, використовуючи стандартний АГ Ця реакція може виявити 25-50% перехворілих птахів. Однак проста техніка постановки її і швидке отримання результатів дають можливість з мінімальними витратами коштів і часу обстежити велику кількість птиці. Специфічний антиген готують з вакцинного вірусу ІЛТ клону НТ. Віруссодержашую суспензію - центрифугат гомогенізованих ХАО - концентрують, використовуючи 1% -ний розчин поліетиленгліколю на дистильованої воді, або поліетиленгліколь (ПЕГ-6000) при додаванні в суспензію з розрахунку 7%.

Антисироватку до вірусу ІЛТ отримують гипериммунизации морських свинок і птахів. У першому випадку використовують концентрований вірус ІЛТ стітром не нижче 108ЕІД5о / мл-, яким імунізують морських свинок за наступною схемою: перша імунізація в обсязі 0,1 мл внутрішньошкірно в плантарную поверхню обох рук, друга імунізація - через 7-9 дн в обсязі 1 мл підшкірно в область верхньої ГУБИ- наступні 2 ін`єкції - через 14-16 і 21-23 днів після другої проводять аналогічно. Через 10 днів після останнього введення АГ морських свинок тотально знекровлюють. Рівень AT в РДП становив, як правило, 1 16 і вище, в лиофилизированном стані сироватки зберігали свою активність 2 м

Птахів (молодиць і птахів у віці 90-120 днів) гіперіммунізіруют за схемою: перший і другий раз (через 2 дн) імунізують специфічним АГ внутрішньовенно в обсязі 1 мл, втретє через 16 днів і четвертий раз через 30 днів -Провід интратрахеально в такому ж обсязі. Через 15 днів після останньої імунізації беруть пробу крові і досліджують на активність і специфічність. Якщо активність сироватки в РДП зі специфічним АГ 1:32 і вище, то у такої птиці тотально (з серця) беруть кров, сироватку від якої лиофилизируют і використовують для виявлення AT в органах і тканинах хворих і загиблих птахів. Якщо титр специфічних ПА в пробі сироватки виявиться нижче ніж 1:32, то птицю імунізують ще раз вірулентним вірусом ІЛТ в розведенні 1: 100 интратрахеально в обсязі 0,5 мл. Через 10-12 днів птахів знекровлюють і сироватку лиофилизируют.

Як розчинник для приготування гелю використовують 0,1 забуферений фіз-розчин NaCl pH 7,2-7,4- забуферений фосфатний розчин складається з 9 частин ОД5М розчину NaCl і 1 ної частини 0,15 м фосфатного буфера РРН 7,2 по Сервісу, веронал-ацетатний буфер з рН 8,6 з іонною силою 0,1 іборатний буфер рН 8,4-8,6. Гель на цих буферних розчинах готують з розрахунку: 1,5 гагара на 100 мл розчинника. Розчиняють агар протягом 1,5-2 ч в киплячій водяній бані, додаючи в розплавлений агар консервант (риванол, азид натрію та ін.). Гарячий агар розливають по 3 мл на предметні стінки або по 35 мл у чашки Петрі, розташовані строго горизонтально. Як тільки агар затвердіє, пластинки можна використовувати в РДП. Таким чином, для діагностики ІЛТ рекомендується РДП на агарових гелі, приготованому на боратному, або фосфатному буферних розчинах. РДП придатне для виявлення специфічних AT в крові хворих і перехворілих птахів, а також вірусного АГ ІЛТ в органах загиблих птіц.Разработани умови отримання специфічного вірусу ІЛТ, активність його РДП 1: 4-1: 32, а в твердофазном ІФА 1: 265-1 : 4000.

ELISA. Виявився більш чутливим, ніж РН, по чутливості наближається до ІФ У окремих експериментально заражених курчат за допомогою ELISA і РИФ вдавалося виявити AT в більш ранні терміни, ніж в РН. Розроблено твердофазний ІФА для виявлення специфічних AT до вірусу ІЛТ в сироватках крові вакцинованих птахів. Методом шахового титрування була вироблена сенсибілізуюча доза антигенів і розведення імунопероксидазному кон`югату. В ІФА можна виявляти специфічні антитіла в титрах 1: 100-1: 200 в сироватках крові вакцинованих птахів. Аналогічні титри в РН і РДП відповідно становили 1: 8-1: 32 і 1: 2-1: 16 (12). ELISA і РН (мікрометод) успішно застосовували для виявлення AT в стадах з субклінічним перебігом ІЛТ. Виявити Післявакцинальні AT до вірусу хвороби в сироватках курчат за допомогою ELISA вдається через тиждень після вакцинації. Також запропоновано удосконалений метод ELISAпутем введення в реакцію авидин-біотин-ферментного комплексу. Він придатний і для оцінки поствакцинального імунітету.

Диференціальна діагностика. При постановці діагнозу на ІЛТ необхідно виключити НБ, віспу, ІБК, заразний нежить, хронічний пастерельоз, респіраторний мікоплазмоз тощо.

імунітет. Захворювання супроводжується тривалим або довічним вірусоносійство. З трахеї перехворіли птахів вірус виділяли протягом 2 років. Змиви з трахеї володіли вірус нейтралізує активністю на 7-8-й дн після зараження. При ІЛТ встановлено важливе значення клітинного імунітету. Імуногенність вакцини залежить від її реактогенності, відзначена тісна кореляція між напруженістю імунітету і титром ВНА (в культурі клітин нирки КЕ). У ряді випадків імунітет наступав раніше, ніж з`являлися гуморальні AT. Формування ВНА і гіперчутливість уповільненого типу не корелює з напруженістю імунітету у вакцинованої птиці.

У Російській Федерації та країнах СНД застосовують суху вірус-вакцину з шт ЦНІІПП. Ними запропонований метод імунізації - втирання вакцини в слизову оболонку верхнього зводу клоаки. Імунітет настає через 7-10 днів і зберігається у більшості птахів протягом всього терміну їх використання. Розроблено і аерозольний метод вакцинації даним препаратом. Запропоновано також жива вірус вакцина з природно-ослабленого штаму ВНІІБП, яку можна застосовувати шляхом втирання в слизову оболонку клоаки і аерозольно. При використанні цього штаму з ГА активністю 1 128-1 512 нанесенням його на кон`юнктиву в дозі 1000 ЕІДзо досягався високий ефект, який оцінювався за рівнем анти ГА вРЗГА Сероконверсія не менше 80% і середньогеометричні титр AT більше 4 log свідчать про напруженому імунітет.

Крім живих культуральних вакцин, в Японії застосовується клітинно-асоційована жива вакцина з вірусу ларинготрахеїту РЄ в вірусінфіцірованних клітинах якої міститься значно більше вірус-специфічних білків, ніж у вільних вирионах. Імунітет у прищепленої птиці розвивався на 6-й день після імунізації. Навіть в 10-кратної дозі вакцина виявилася безпечною для курчат.

Запропоновано також жива вакцина проти ІЛТ і хвороби Марека, яка індукувати імунітет до обох вірусів при підшкірному і внутрішньом`язовому введеннях. Показана ефективність одночасної вакцинації курчат проти НБ іІЛТ Виявилося, що вакцинний штам Ла-Сота не робить гальмуючих дій нарепродукцію шт ВНІІБП вірусу ІЛТ в КЕ. Біологічна активність ііммуногенность вирусвакциной ІЛТ курей із клону НТ не змінювався при зберіганні її протягом 12 міс при температурі 2-6 ° С.

Переважний метод імунізації - закопування вакцини на кон`юнктиву або застосування її у вигляді аерозолю Вакцинація аерозолем, що містить вакцинний вірус, може супроводжуватися небажаними наслідками особливо при наявності в господарстві микоплазменной інфекції. При аерозольній вакцинації імунітет розвивається через 4-5 дн і зберігається до року. В даний час ВРф застосовують вакцини ВНІІБП і ВНІІВВіМ Перша після дворазового аерозольного застосування (5-7,5 lg ЕІД 5о) створювала імунітет у всіх 5-6 - тижнів курчат яєчних стад і у 80% курчат м`ясних порід курей. Через 4,5 міс після вакцинації у 90% курей зберігався напружений імунітет. Вакцину ВНІІВВіМ готують з ат-тенуірованного шт НТ, вона менш реактогенна при аерозольному застосуванні. Незважаючи на високу біологічну активність і ареактогенность вакцини проти ІЛТ з клону НТ, не рекомендується використовувати її для вакцинації різновікових курчат і там, де немає необхідних умов для створення потрібної її концентрації в пташнику. Вакцина Проти ІЛТ з клону НТ при клоачного методі застосування в дозі 11240 ЕІД 5о і вище формує у 30-40 дн курчат напружений імунітет після одноразової вакцинації.

Щодо ефективності інактивованої вакцини в літературі є суперечливі дані Для виготовлення інактивованої препарату використовують р-пропілактон, етіленімін, формалін. Одноразова Імунізація курчат інактивованої емульсин-вакциною повідомляє стійкість курчат до зараження протягом 12 міс. Таким чином, отримана ефективна інактивована вакцина, яку рекомендовано застосовувати в господарствах з частими спалахами ІЛТ.

Генно-інженерні вакцини. Незалежно від методів аплікації живий вірус-вакцини у птиці спостерігається досить тривалий носійство вакцинного вірусу. Аттенуіровані вакцини можуть бути причиною виникнення латентної форми інфекції. Розробляються генно-інженерні вакцини позбавлені цього недоліку. У поєднанні з гігієнічними заходами такі вакцини могли б привести до викорінювання ІЛТ до 2000р. в птахівницьких хозяйствах.Опісани методи конструювання мутантів вірусу ІЛТ, у яких ген ТК (тимідинкінази) инактивирован мутаціями різного типу: делеціями (наприклад ділянки ДНК між 2 сайтами Narl), вставками чужорідної ДНК або делецией і вставкою. Ці мутанти не продукує функціональну ТК і є аттенуіро-ванними. У ген ТК вірусу ІЛТ можна вбудовувати гетерологічние гени, що кодують АГ патогенів птахів: вірусів БМ, НБ, ІБК, ретровірусів і т.д. Такі Варіанти вірусу ІЛТ можна використовувати в якості вакцинних векторів, які індукують імунну відповідь. Отримано позитивний результат при використання для специфічної профілактики ІЛТ очищеного афинной хроматографією глікопротеїну.

Оцінка поствакцинального імунітету. Кури, які перехворіли інфекційним ларинготрахеїтом, в природних умовах набувають практично довічний імунітет. Встановлено, що дворазова асоційована аерозольна імунізація птахів проти НБ, ІЛТ і віспи не пригнічує клітинних і гуморальних показників імунітету. Більшість дослідників поствакцинальний імунітет оцінюють за рівнем ВНА, а напруженість - шляхом контрольного зараженія.Установлена тісну кореляцію між напруженістю імунітету і титром в перші 2 тижні після вакцинації. У ряді випадків курчата можуть бути стійкі до зараження, але серонегативного, що свідчить про те, що імунний стан настає раніше, ніж з`являються AT в крові.

У сироватках крові вакцинованих курей на 10-14-й дн виявляють ВНА. У невеликих титрах вони у птахів виявлялися в РН через 55 тижнів після вакцинації. Встановлена пряма залежність між рівнем захисту курей після вакцинації і титрами ВНА. При титрі поствакцінальньгх антитіл Г 76, Мб, 1: 10і Г8 відсоток захворюваності птиці після експериментального зараження становив 0,45, 55 і 100% відповідно. Птах, імунізованих клоачного, що не захворює при інтратрахеально зараженні, а вижила після інтратрахеально вакцинація залишається несприйнятливою при зараженні в клоаку. У зв`язку з цим поствакцинальний імунітет оцінюють за наявністю ВНА в сироватці крові вакцинованих курей, а також за результатами біопроби (клоачного реакція). Для орієнтовної оцінки напруженості імунітету птахів після вакцинації проти ІЛТ можна використовувати РДП і РІЕФ, але вони менш показові. Зв`язок титрів AT з вірусоносійство і вірусовиделеніе не вивчена.

Пасивний імунітет. Зараження 1-денних курчат, отриманих від вакцинованих птахів, призводило до 40% -ної захворюваності і смертності- загибель курчат, отриманих від НЕ імунної батьків, становила 100%. Кури, що містять ВНА в титрі 1:76 не захищають потомство і в організмі їх можлива репродукція вірусу в ранньому віці.



Увага, тільки СЬОГОДНІ!