Виявлення резистентності до метициліну та іншим b-лактамних антибіотиків методом скринінгу

З моменту появи в 70-х роках метіціллінорезістентние стафілококи і перш за все метіціллінорезістентниештамми Staphylococcus aureus (MRSA) є одними з провідних возбудітелейнозокоміальних інфекцій. Частота MRSA в структурі стафілококових інфекцій впоследние роки різко зросла в усьому світі, наприклад, в США з 2% в 1975 р до35% в 1996 р

Резистентність стафілококів до оксациліну (метициліну) може бути обумовлена трьома основними механізмами:

• продукцією додаткового пеніцилін білка (ПСБ) - ПСБ-2а (ферменту, який бере участь в сінтезеклеточной стінки), кодованого хромосомальним геном mecА - класична, іліістінная резистентність до метициліну (оксациліну)
• інактивацію внаслідок гіперпродукції бета лактамаз
• модифікацію нормальних ПСБ

З клінічної точки зору, важливо диференціювати штами з класичної (mecА-обумовленої) резистентністю від штамів з двумядругімі редковстречающіеся механізмами резистентності, які зумовлюють нізкійілі прикордонний рівень стійкості. Це пов`язано з тим, що при інфекціях, викликаних штамами з mecA-обумовленої резистентністю, терапіябета-лактамними антибіотиками (пеніцилінами, цефалоспоринами, карбапенеми) буде неефективна.

Крім того, ці штами часто бувають резистентні практично до всіх інших класів антибіотиків за винятком глікопептидів (ванкоміцин, тейкопланін). Фенотипічні характеристики, які можуть помочьдіфференціровать три перерахованих механізму резистентності, викладені втабліце.

ТИПИ резистентні до метициліну (оксациліну) У стафілокок

Штами з класичним типом резистентності можуть в свою чергу бути гомо- або гетерогенними за типом експресії стійкості. Прігомогенном типі експресії практично всі мікробні клітини проявляютрезістентность в стандартних in vitro тестах, в той час як при гетерогенномтіпе тільки невелика частина клітин проявляє резистентність фенотіпіческі.Нередко тільки 1 з 10-100 млн клітин в популяції з наявністю гена mecАекспрессірует резистентність, що обумовлює отримання погранічнихрезультатов при визначенні чутливості до оксациліну (МПК - 2-8 мг / л) .Резістентность, обумовлена гіперпродукцією b-лактамаз і мутацією нормальнихПСБ, також призводить до получ нию прикордонних значень МПК. Однак резістентностьк оксациллину, обумовлена гіперпродукцією b-лактамаз, легко відрізняється отклассіческой резистентності по її оборотності при використанні інгібіторовb-лактамаз.

На відміну від штамів з класичною резистентністю гіперпродуценти b-лактамаз і штами з мутаціями нормальних ПСБ зазвичай не імеютмножественной резистентності до інших антибіотиків.

Наявність класичної резистентності найбільш легко визначити методом скринінгу, так як зростання мікробних клітин з неклассіческімітіпамі резистентності зазвичай ингибируются.

Для визначення чутливості використовується оксацилін зважаючи на його більш високої стабільності при зберіганні в порівнянні сметіцілліном.

ПРИНЦИП

Для ідентифікації резистентності до оксациллину (метициліну) у стафілококів, слід дотримуватись таких умов:

• додавання 4% NaCl в агар з оксациллином (pH 7,2-7,4, так як при більш низькому pHувелічівается число помилково негативні результати) -
• температура інкубації 35^oС-
• тривалість інкубації 24 год для S.aureus і 48 ч - для коагулазоотріцательних стафілококков-
• стандартизоване число мікроорганізмів.

мікроорганізмів

Чистий культура Staphylococcus spp., Інкубували протягом 18-24 год на кровяномагаре.

МАТЕРІАЛИ

1. Агар Мюллера-Хінтон з додаванням 4% NaCl (4 г на 100 мл середовища) і 6 мг / л оксациллина (0,6 мг на 100 мл середовища). Агар Мюллера-Хінтон хранітсяпрі температурі 2-8oС, готується згідно прописи на етикетці, 4% NaClдобавляется до автоклавування.
2. Субстанція оксациліну з відомою активністю предварітельнорастворяется в стерильній дистильованій воді (розрахунок концентрацііоксацілліна проводять з урахуванням його активності) і додається в охлажденнийна водяній бані до 48 -50oС агар Мюллера -Хінтон. Приготований агарразлівается по чашках з товщиною шару 3-4 мм (на чашку діаметром 100 мм -25 мл). Готові чашки з середовищем зберігаються в пластикових пакетах притемпературі 4 -8oС не більше 5 діб.
3. Для контролю зростання необхідно також приготувати чашки з агаром, що містить 4% NaCl, але без антибіотика.
4. Кров`яний агар з чистою культурою стафілокока, інкубувати напротязі 18 -24 год.
5. Стерильний фізіологічний розчин.
6. Стандарт мутності 0,5 за МакФарланда.
7. Стерильні тампони або микропипетка (10 мкл).
8. Термостат з температурою інкубування 35^oС.

КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ

Дослідження проводять при обов`язковому контролі росту досліджуваних культур на агарі Мюллера-Хінтон з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само, як на агар з оксациллином).

Контрольні штами:

S.aureus ATCC 38591 - резістентний-

S.aureus ATCC 29213 - чутливий.

ПОСТАНОВКА ТЕСТА

Приготування інокулюму. Бактеріальну суспензію стафілококу готують з декількох колоній з однаковою морфологією настерільном фізіологічному розчині (3 мл) і доводять до каламутності 0,5 помаки-Фарланда (1,5 · 108 КУО / мл).

Інокуляція. Метод I (мікропіпеткою):

1. приготувати розведення 1: 100 стандартного інокулюму 0,5 помаки-Фарланда для отримання бактеріальної суспензії, що містить 1,5 · 106 КУО / мл (наприклад, додати 0,1 мл стандартної суспензії до 9,9 мл стерільногофізіологіческого розчину) -
2. за допомогою микропипетки нанести краплю (10 мкл) разведеннойстандартной суспензії на поверхню агару з оксаціл лином.

Метод II (за допомогою тампона):

1. занурити стерильний ватний тампон в пробірку состандартізірованной суспензією (0,5 по МакФарланда), потім віджати ізбитоквлагі об стінку пробіркі-
2. торкнутися тампоном поверхні агару з оксациллином.

ІНКУБАЦІЯ

Штами S.aureus інкубують при температурі 35oС протягом 24 год, а коагулаза (-) стафілококів - напротязі 48 годин.

Примітка. Середа АГВ не може бути рекомендована для постановки тесту в зв`язку з високою частотою хибнопозитивних результатів.

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТУ

інтерпретація:

• поява видимого зростання більше 1 колонії на місці нанесення культури означає стійкість данногоштамма до оксациллину (метициліну) -
• при відсутності росту на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий кметіцілліну (оксациллину).
• при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених у хворих з клініческінееффектівной терапією і у хворих з серйозними інфекціями, необхідно провестіразвернутое дослідження з визначенням МПК до оксациллину і гена mecA.

Подання результату:

• S.aureus або коагулаза (-) стафілокок (S.epidermidis), чутливий до метициліну (оксациліну) -
• S.aureus або коагулаза (-) стафілокок (S.epidermidis), резистентний до метициліну (MRSA або MRSE).

Метицилін (оксацилін) резистентні стафілококи повинні розцінюватися як резистентні до всіх b-лактамів - пеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемів, комбінаціям пеніцилінів з інгібітораміb-лактамаз. Крім того, серед метіціллінорезістентних стафілококів дуже частонаблюдается асоційована резистентність до інших антибіотиків - аміноглікозидів, макролідів, хінолонів, тетрацикліну.

ОБМЕЖЕННЯ МЕТОДУ

1. Скринінг на агарі з оксациллином призначений для фенотіпіческогоопределенія штамів, що мають ген mecA. Однак штами з іншими тіпамірезістентності іноді можуть давати хибнопозитивний результат.
2. Метод скринінгу для виявлення резистентності до оксациллину (метициліну) менш надійний у коагулаза (-) стафілококів, ніж у S.aureus.

Примітка. Оксациллин в порівнянні з метициліну менш стабільний до дії стафілококковихb-лактамаз, що може привести до отримання більшого числа ложноположітельнихрезультатов, ніж при використанні метициллина. У той же час метицилін всравненіі з оксациллином значно менш стабільний при зберіганні, що іогранічівает його застосування.

Ванкоміцинорезистентності Staphylococcus aureus

Про можливість появи ванкоміцинорезистентності штамів S.aureus сталізадумиваться близько 10 років тому після сообще ний про появу резистентності кванкоміціну у ентерококів.

Перше повідомлення про виділення метіціллінорезістентних S.aureus зі сніженнойчувствітельностью до ванкоміцину (МПК 8 мг / л) з клінічного матеріалапоявілось в 1996 р

Незважаючи на значення МПК до ванкоміцин, відповідне діапазону умереннойрезістентності, даний штам був зареєстрований як VRSA (ванкоміцинорезистентності S.aureus) через клінічної нееффектівностіванкоміціна. У цього штаму не було знайдено жодного з раніше ізвестнихмеханізмов резистентності до ванкоміціну- відзначено тільки збільшення толщіниклеточной стінки і концентрації пеніцилін-зв`язуючих білків 2 і 2а.

Далі одна за одною пішли повідомлення про виділення з клінічного матеріалаштаммов S.aureus з МПК до ванкоміцин 8 мг / л, позначених як VISA (S.aureus сосніженной чутливістю до ванкоміцину).

В результаті поглибленого дослідження ванкоміцинорезистентності у MRSA пріскрінінге більш ніж 2000 штамів з різних стаціонарів було виявлено від 1 до25% (!) Штамів з гетерогенної (індуцібельной) резистентністю до ванкоміцину, що експресують її з частотою близько 1 клітини на 1 млн. Такі штами могутявляться предше ственник VRSA.

Фахівці поки не дійшли згоди, який термін використовувати: VRSA або VISA. Етосвязано з тим, що, незважаючи на значення МПК, відповідні діапазонуумеренной резистентності, в наявності клінічна неефективність ванкомицина прітерапіі VRSA- і VISA-інфекцій.

Багато фахівців пропонують свої методи скринінгу ванкоміцинорезистентності устафілококков. Однак загальноприйняті стандарти ще не розроблені.

Таким чином, надзвичайно важливою є розробка методів лабораторної діагностики імоніторінга ванкоміцинорезистентності, особливо у пацієнтів, які отримують іліполучавшіх ванкоміцин / тейкопланін, і при неефективності цієї терапії.

Слід розробити методики контролю за VRSA-інфекціями. Для предупрежденіяраспространенія VRSA необхідно ізолювати хворих і носіїв S.aureus. Крімтого, застосування антибіотиків повинно передбачати зниження чісланеобоснованних призначень ванкомицина.

У Росії поки не описано жодного штаму S.aureus зі зниженою чувствітельностьюк ванкомицину. Найімовірніше це пов`язано з рідкісним використанням ванкоміцінав клінічній практиці.