Діагностика стафілококових інфекцій

Відео: Золотистий стафілокок | Staphylococcus aureus

Незважаючи на те, що стафілококи належать до числа найбільш легко виявляються і розпізнаваних мікроорганізмів, які не потребують складних діагностичних прийомів для їх виявлення, в практичній роботі мікробіологи досі відчувають певні труднощі при встановленні їх причинного ролі в ряді різних захворювань. З одного боку, присутність патогенних стафілококів, що виявляється в досліджуваному матеріалі, не завжди є переконливим доказом їх етіологічного значення. З іншого, з огляду на велику різноманітність проявів біологічної активності цих мікробів, залежне від різних, не завжди піддаються обліку чинників, широку їх мінливість під впливом лікарських речовин і самого макроорганізму, досить складно буває визначити їх потенційну патогенність. Нарешті, третя причина пов`язана з тим, що стафілококи є представниками нормальної мікрофлори з групи умовно патогенних мікроорганізмів і, поряд з непатогенних, патогенні представники мешкають в організмі людей, поширюючись при цьому вельми нерівномірно на різні ділянки людського тіла.

Якщо виділення патогенного стафілокока, з крові хворих людей і різних порожнин, які прийнято вважати стерильними, в переважній більшості випадків може бути доказом його ролі як збудника хвороби, то присутність стафілококів на слизових зіва, носа і т. Д. Навіть при явному хворобливому стані їх вимагає великої обережності дослідника в висновках про етіологію даних захворювань.

Тому, природно, не може бути загальних рекомендацій, як при діагностиці різних стафілококових інфекцій, так і при мікробіологічних дослідженнях ділянок тіла людини і різних об`єктів зовнішнього середовища. Широкий обмін думками між мікробіологами наукових установ та практичних лабораторій, здійснюваний на з`їздах і конференціях, присвячених проблемам стафілококових інфекцій, а також при особистих контактах, здавалося б, повинен був привести до певних поглядів на різні методи дослідження, пропоновані для виділення та ідентифікації стафілококів. Однак велика кількість запитів, що надходять з лабораторій СЕС і лікувальних установ, свідчить про явні труднощі, які виникають у дослідників при вирішенні різних питань мікробіологічної діагностики стафілококів, а в ряді мікробіологічних установ існують ще деякі застарілі методи і прийоми, що призводять до неправильних оцінок і навіть прикрих непорозумінь.

Важливою умовою ефективності лабораторної діагностики є поєднане визначення якісних і кількісних критеріїв змісту патогенних стафілококів в досліджуваному матеріалі. Виходячи з цього, я вважаю за необхідне викласти ряд методів основних мікробіологічних досліджень, найбільш простих і доступних для кожної практичної та наукової лабораторії, якими ми користуємося протягом багатьох років.

Основні принципи ВИЯВЛЕННЯ І ІДЕНТИФІКАЦІЇ патогенний стафілокок

Попередня діагностика стафілококів може грунтуватися на бактеріоскопічному вивченні препаратів - мазків, забарвлених по Граму. Патогенні стафілококи, крім гроздевидного розташування, характеризуються правильної сферичної формою клітин. Виявлення стафілококів, що знаходяться всередині клітин, дозволяє дати відповідь про наявність стафілококової інфекції. У більшості ж випадків для точного встановлення патогенності виявлених стафілококів потрібно виділити ці мікроорганізми в чистій культурі шляхом посіву досліджуваного матеріалу на щільні поживні середовища.

В даний час асортимент диференціальних, елективних і накопичувальних середовищ, запропонованих для виділення патогенних стафілококів, досить значний і продовжує розширюватися. Багато дослідників на основі знання основних біохімічних характеристик і поживних потреб патогенних стафілококів при конструюванні середовищ прагнуть підвищити їх висеваемость і забезпечити можливість здійснювати їх кількісний облік, отримати надійний спосіб відрізняти потенційно хвороботворні стафілококи від сапрофітів.

Вживання рідких накопичувальних середовищ для первинного виділення стафілококів недоцільно, так як позбавляє дослідника можливості кількісної оцінки змісту мікробів в обстежуваних об`єктах, а при випадкових забрудненнях сприяє помилкам. Особливо це відноситься до таких досліджень, як виявлення носійства патогенних стафілококів, де доказом є лише масивний зростання, або визначення етіологічної ролі цих мікроорганізмів "при харчових отруєннях або зовнішніх запальних процесах. Якщо ж мова йде про дослідження крові, а також про тих небагатьох випадках, коли буває необхідно виявити навіть поодинокі життєздатні особини цих мікробів, наприклад при контролі ефективності дезінфекції, перевірці на стерильність або тітраціонних посівах, то подібних випадках використання накопичувальних середовищ цілком виправдано.

З великого числа різноманітних поживних середовищ, випробуваних для первинного виділення стафілококів, в практиці виправдав, -1 "себе не всі. Звичайний живильний агар (рН 7,2 7,4), приготований шляхом додавання 2% агар-агару до мясопептонний бульйону або до триптичного переварити Хоттингера, може бути використаний при дослідженні ексудатів з закритих порожнин. Стафілококи виростають через 18-24 год інкубації при 37 ° с у вигляді гладких блискучих з рівними краями непрозорих і злегка опуклих колоній. Характер пігменту виявляється краще остан е додаткового добового витримування чашок при кімнатній температурі (20 ° С) на світлі. Якщо в досліджуваному матеріалі присутній стороння флора, то за зовнішнім виглядом колонії стафілококів можуть бути важко відрізнити.

Вживання кров`яного агару дає можливість, крім виявлення пігменту, визначити і гемолітичну активність стафілококів. При цьому необхідно пам`ятати, що гемолітична здатність, яка визначається на чашках з кров`яним агаром, залежить від багатьох чинників - виду крові, її концентрації, наявності в ній антитоксинів, товщини шару середовища, вмісту вуглекислого газу в атмосфері культивування, густоти посіву, присутності і характеру супутньої флори і т. д.

При відборі колоній з кров`яного агару необхідно отвівают як гемолітичні, так і не дають гемолізу, особливо якщо дослідження проводиться на середовищі з людською або кінської кров`ю, а відсутність гемолізу на таких середовищах не дозволяє зробити висновок про відсутність взагалі гемолітичної активності. Тому використання кров`яного агару для первинного посіву доцільно тільки при обстеженні об`єктів, що не містять сторонньої мікрофлори, і бажано додавати в живильне середовище кров кролика або барана.

Якщо ж проводиться дослідження гною відкритих ран або відокремлюваного виразок або нориць, то слід користуватися елективний-диференціальної середовищем для стафілококів - желточно-сольовим агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Елективних цього середовища забезпечується високим вмістом хлористого натрію, а доданий яєчний жовток дозволяє виявляти лецітовітеллазной активність, яка є одним з показників патогенності стафілококів і в силу цього ЖСА чіткіше диференціює патогенних представників, ніж кров`яний агар. Приготування ЖСА нескладно.

Заготовляють про запас і стерилізують в автоклаві при 120 ° С "протягом 20 хв поживний агар (МПА або Хоттингера) рН 7,2-7,4, що містить 10% кухонної солі. Перед вживанням сольовий живильний агар розтоплюють, остуджують до 45-50 ° з і додають до нього 20% за обсягом стерильною желточной суспензії (1 жовток курячого яйця на 200 мл фізіологічного розчину). Для кращого емульсірованія бажано мати колби зі скляними намистом. Після ретельного перемішування середовище розливають по 20-25 мл в чашки, які можуть зберігатися в холодильнику протягом нескол ькіх днів.

Слід виробляти масивний посів досліджуваного матеріалу на чашки з ЖСА, а інкубацію вести протягом 2 діб при 35-37 ° С. Стороння флора різко пригнічується, стафілококи ж на ЖСА виростають практично в чистій культурі. Безпосередньо під час перегляду чашок навколо колоній відзначається утворення райдужних віночків і каламутній зони - лецітовітеллазной реакція. Такі колонії, не менше двох з кожного посіву, отвівают на скошений м`ясо-пептони агар для подальшої перевірки виросли культур в реакції плазмо-коагуляції.

Щоб уникнути помилок у визначенні желточной реакції, необхідно мати на увазі, що іноді спостерігається помутніння середовища без веселкового обідка, в цьому випадку проба на лецітовітеллазу вважається негативною. Якщо ж колонії, що виросли на ЖСА, не дають лецітовітеллазной реакції, т. Е. Оточені райдужним віночком, але є ріст стафілококів, то їх теж вважають підозрілими і також отвівают не менше двох з кожного такого посіву на чашки з простим живильним агаром плямами діаметром 5-10 мм. Після добового інкубації при 37 ° С отримані макроколоніі перевіряють в реакції плазмоагглютінаціі, для чого мікробну масу розмішують петлею на склі в краплях цитратной кролячій або людської плазми, розведеною 1: 4. Освіта пластівців враховують протягом 30с-1 хв. При наявності плазмоагглютінаціі такі штами вважають підозрілими і отвівают на скошений агар для подальшого вивчення в коагулазной реакції. При такому відборі число пропускаються штамів патогенних стафілококів людського походження невелика, культури же, виділені від тварин, потрібно перевіряти в реакції плазмокоагуляции.

Коагулазной проба є основною ознакою, що визначає хвороботворність стафілококів, тому її постановка вимагає до себе максимальної уваги. Для виявлення коагулазной активності у стафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цілісної кров`ю, так і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров або плазму, взяту безпосередньо від людини. Консервована плазма або кров, що використовуються для переливання, непридатні для реакції, так як до них часто додаються консерванти, які перешкоджають життєдіяльності стафілококів, прояву коагулазной активності. Не слід застосовувати кров тварин або людей, що переносять стафілококові захворювання, особливо затяжні, так як вона може виявитися нестерильний і містити антікоагулазу. При роботі зі стафілококами, виділеними від рогатої худоби, можна користуватися бичачої кров`ю.

Асептично взяту кров стабілізують за допомогою 1-4% цитрату або 0,1% оксалату. Для отримання плазми нітратну кров центрифугують або відстоюють на холоду. Але, як вже говорилося, можна користуватися і цілісною кров`ю. Потім кров розводять стерильним фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 3 або 1: 5 і розливають по 0,2-0,3 мл в стерильні пробірки, які перед стерилізацією повинні бути ретельно вимиті, так як залишки хімічних речовин можуть впливати на результат плазмокоагуляции.

Випробовувані агарові культури стафілококів вносять петлею в плазму і добре перемішують. Бульйонні культури вносять піпеткою в обсязі 0,1 мл У кожному досвіді необхідно ставити контроль з культурами свідомо патогенних стафілококів, що дають коагулазной реакцію, і штамами коагулазоотріцатель-них мікроорганізмів. Крім того, частина пробірок з розлитої плазмою слід залишати не засіяної мікробами і витримувати в термостаті протягом усього терміну досвіду. У разі настання коагуляції хоча б в одній з них весь досвід потрібно переставити з новою порцією крові. Пробірки з досліджуваними культурами витримують в термостаті при 37 ° С протягом доби. Облік результатів проводиться обов`язково двічі: через 2-3 год і 24 ч. Враховують згортання плазми і утворення згустків. Зазвичай культури, активно продукують коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 ч. А якщо вони володіють і вираженою фібринолітичної активністю, то спочатку утворилися згустки можуть піддатися розплавлення до кінця доби. Слабокоагулірующіе штами можуть давати позитивну реакцію в пізні терміни-до кінця доби. Досліди, що дали сумнівний результат, необхідно повторити.

Деякі дослідники, отримавши негативний або сумнівний результат, залишають пробірки на столі. Цього робити не можна, так як згортання плазми в більш пізні терміни може носити не специфічний характер і його не слід брати до уваги.

Стафілококи, що дають позитивну коагулазной пробу, повинні розглядатися як потенційно патогенні, незалежно від наявності або відсутності у них гемолітичних властивостей і характеру пігменту, їх відносять до виду St. aureus і надалі піддають фаготіпізаціі і перевірці на чутливість до антибіотиків.

Поглиблене вивчення стафілококів показало, що основна ознака па-тогенності - коагулазной реакція може піддаватися мінливості при впливі різних факторів (Г. Н. Чистович, 1961- Е. М. Падеріна, 1966), тому в ряді випадків, при виділенні коагулазонегатівних стафілококів в монокультурі з патологічних вогнищ, доцільно вивчити у них інші ознаки потенційної хвороботворності і перш за все - здатність ферментувати маніт в анаеробних умовах. Відомо, що серед коагулазоотріцательних частина культур має здатність розщеплювати маніт в анаеробних умовах (8,4% -за даними А. А. Акатова і М. Л. Хатеневер, 1974).

Визначення ферментації маніту в анаеробних умовах технічно дуже просто і здійснюється шляхом посіву уколом досліджуваних культур в пробірки з високим стовпчиком напіврідкого агару Хоттннгера, що містить 1% маніту і 0,004% індикатора бромкрезолпурпура або бромтимолблау (рН == 7,2). Цієї середи перед посівом «регенерують», т. Е. Кип`ятять на водяній бані, швидко охолоджують, а після посіву заливають шаром стерильного вазелінового масла. Посіви інкубують при 37 ° С протягом 5 днів. Однак в значній кількості випадків результати можуть бути враховані вже через добу.

Поряд з реакцією плазмокоагуляции, велике значення набула ще одна важлива здатність стафілококів, що характеризує їх потенційну патогенність, -дезоксірібонуклеазная активність. Багато дослідників повідомляють про високу кореляцію цієї ознаки з коагулазной активністю і токсигенних досліджуваних культур-відзначають, що стафілококи, виділені з патологічного матеріалу, як правило, мають ДНК-азой. Коагулят-зопозітівние штами, отримані від носіїв, можуть не мати цього ферменту, і зазвичай відсутність дезоксірібонуклеазной активності поєднується з низькою біохімічної здатністю і атоксігенностью таких культур стафілококів.

За спостереженнями деяких дослідників, серед коагулазонегатівних штамів стафілококів, але володіли іншими ознаками патогенності, виділених у ряді випадків від хворих з різними гнійними інфекціями, дезоксірібонуклеазную активність проявляли від 10 до 29% таких культур (І. І. Панишева і співр., 1967- Franklin і співавт., 1966- Lierd і Golde, 1970).

В даний час цей тест може служити надійним диференціальних ознакою між патогенними і непатогенних стафілококами і в той же час може допомогти в диференціації ступеня патогенності коагулазопозітівних штамів і, безумовно, приверне увагу до коагулазонегатівних, але володіє цим ферментом культур стафілококів і в ряді випадків дозволить віднести останні до хвороботворним форм з більшою впевненістю.

Методика визначення дезоксірібонуклеазной активності нескладна, в основу її покладено метод Джеффріса. Готують про запас 2% МПА (рН-8,6), що містить ДНК (2 мг / мл середовища), розливають по флаконах та стерилізують текучим паром протягом 30 хв. Перед розливом в чашки до середовища додають CaCIa (0,8 мг / мл). На підсушену середу засівають добові культури стафілококів. Після інкубації протягом 18-20 год при 37 °, на поверхню середовища наливають IN розчин НС1 і через 7-10 хв враховують зони просвітління, які оцінюють хрестами (Н. Б. Мордвинова і співавт., 1967).

Нами запропонований більш економічний метод для виявлення ДНК-ази у мікроорганізмів. Цей спосіб, крім зменшення в 2 рази витрати ДНК на кожен досвід, дозволяє використовувати більш дешеву нізкополімерной нуклеїнових кислот, виготовлену Олайнського заводом хімічних реактивів. Пропонована методика широко апробована на кафедрі мікробіології ЛСГМІ і за якістю результатів не поступається загальноприйнятою. Тому ми наводимо її докладний опис.

Для приготування робочого розчину ДНК, навішення нуклеїнової кислоти з розрахунку 10 мг / мл поміщають у дистильовану воду, додають 0,5 мл 0,2% (або 0,8%) розчину NaOH на кожні 10 мл води. Для кращого розчинення ДНК суміш або нагрівають до кипіння на водяній бані при постійному перемішуванні скляною паличкою, або залишають на ніч при 37 ° С в термостаті. До розплавленого і охолоджений до 50 ° С МПА додають робочий розчин ДНК з розрахунку 1 мг / мл (на 9 мл МПА-1 мл розчину ДНК), перемішують, розливають по10л (л в пробірки, стерилізують текучою парою протягом 30 хв або в автоклаві при 0,5 атмосфери протягом 20 хв. Термін зберігання-1-2 міс.

При постановці досвіду стовпчики агару з ДНК розтоплюють, на водяній бані додають 0,1 мл офіцинального стерильного 10% розчину СаСЬ, перемішують і виливають на шар добре підсушеного поживного агару в чашки Петрі і знову підсушують. Добову агарове культуру засівають маленькими бляшками (діаметр дорівнює 2-2,5 мм) або штампом-репликатором не більше 20-25 бляшок, щоб уникнути злиття зон деполімеризації ДНК. Після 18-20-годинної інкубації поверхню агару заливають 5 мл IN розчину НС1 і через 3-5 хв враховують зони просвітління. Реакції оцінюють в крестах.Прі цьому слід врахувати, що інтенсивність зони деполімеризації на щільному середовищі не завжди збігається з кількістю продукції цього ферменту у досліджуваних стафілококів в рідких середовищах.

Для виявлення фибринолизина використовують кілька вдосконалений метод Крісті з співр.

Середа Крісті-Чепмена має наступний склад: м`ясний екстракт-0,45 г, пептони-0,75 г, хлористий натрій-1,2 г, агар-2,75 г, вода-130 мл, рН середовища == 7,0 . Стерилізується в автоклаві і зберігається запас.

Перед досвідом середу розтоплюють, остуджують до 50 ° С і додають 15-20% стерильною цитратной людської плазми. Суміш прогрівається в водяній бані при 65-70 ° С протягом 2 5 хв до появи ясною каламуті, а потім розливається в чашки. Випробовувані культури засівають «плямами» по 15-20 на чашку. Посіви інкубують при 37 ° С. Враховується освіту зон просвітління навколо колонії спочатку через 14 год, потім через 24 і 48 ч, так як реакція у різних культур тече неоднаково швидко і у ряду штамів вона розвивається в більш пізні терміни.

Фібринолітичний тест ми вважаємо вельми придатним для визначення потенційної хвороботворності стафілококів, але оцінюємо тільки в комплексі з іншими ознаками актівності.Гіалуронідазная активність визначається за методом Мак-Клину в модифікації М. Ш. Могильовського і Л. С. Коган (1949).

Розчин гиалуроната дає в присутності 2 N оцтової кислоти типовий згусток, розливається по 0,5 мл в стерильні пробірки. Додається 0,5 мл добової культури стафілокока в пептонов воді. Контролями служать: гіалуропат + дистильована вода і гіалуропат + незасіяні середу. Суміші встряхиваются і витримуються при 37 ° С 15-20 хв. Потім в кожну пробірку додається по дві краплі 2 N розчину оцтової кислоти і струшується. В контролях повинен утворитися слизовий грудочку. Під час експерименту при наявності гіалуронідази він відсутній, що свідчить про деполімеризації гіалуронової кислоти мікробним ферментом.

Для вивчення токсигенності стафілококів зручно користуватися методом, запропонованим Илеко і Леві (1950), що дозволяє визначити типи гемолізінов.С цією метою готуються чашки з живильним агаром, що містить 5% відмитих фізіологічним розчином еритроцитів барана, кролика і человека.Но поверхню живильного середовища по діаметру поміщають стерильну смужку фільтрувального паперу, змочену альфа-антитоксичної сироваткою. Відступивши 1-2 мл від краю смужки, перпендикулярно до неї засівають штрихами досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 ° С протягом доби, після чого враховують результати.

Альфа-гемоліз проявляється у вигляді повного просвітління середовища навколо штриха культури і нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Він виявляється на середовищах з кролячими і баранячими еритроцитами

Бета-гемоліз на агарі з баранячою кров`ю дає часткове просвітлення, зона якого має буро-пурпурний відтінок. Це «тепло-холодовий» токсин і краще виявляється після додаткового добового витримування чашок в холодильнику при температурі +4 ° С по характерному пошаровому гемолизу баранячих еритроцитів і не централізується альфа-антитоксичної сироваткою. На кролячих еритроцитах він не активний. Дельта-гемолізини визначається по вузькій смужці гемолізу баранячих та кролячих еритроцитів, що не нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Однак освіту дельта-гемоли-зина на цих чашках може бути замасковано дією альфа-токсину і тому його слід перевіряти на середовищах з еритроцитами людини або коня. Таким чином, для визначення всіх 3 типів гемолізинів досить використовувати еритроцити барана і людини або коня.

Для визначення вірулентності стафілококів існують кілька різних методів зараження білих мишей.Наіболее простим є введення 0,1 мл добової бульонной культури випробуваного стафілокока в хвостову вену. Облік загибелі тварин здійснюється протягом 10 діб, реєструють наявність абсцесів в нирках.

Зручно користуватися способом Badenski і співр. (1958), Добова бульйонна культура центрифугируется при 3000 об / хв - 30 хв. Отриманий осад ресуспендіруєтся в половинному обсязі декантата і в кількості 0,05 мл вводиться 6 мишам позаду очного яблука в область навколо очей клітковину. Культуру, яка викликає загибель половини і більше заражених мишей протягом 6 днів, вважають вирулентной.

При цих методах зараження вірулентної культурою у тварин розвивається громад септичний процес з переважним ураженням нирок. Основна загибель мишеі відбувається на 3-5-й день після зараження.

Інші способи зараження білих мишей (внутрішньочеревно і інтраназальний) вимагають в десяткіраз більшою заражає дози, максимум загибелі мишей доводиться на 1-2-е добу, що характеризує переважно токсичний компонент процесу (С. А. Анатолій, І. І. Антонівська, 1967) У той же час ряд дослідників віддають перевагу більш простому технічно внутрибрюшинному способу зараження мишей, який одночасно дозволяє вивчати клітинні і гуморальні механізми розвитку інфекції.

Зіставлення вірулентності стафілококів для білих мишей з окремими факторами їх патогенності показало, що вірулентність штамів, за даними великої кількості дослідників, корелює з рівнем альфа-гемотоксини. Що стосується інших ознак патогенності і їх кореляції з вірулентністю, то отримані суперечливі відомості. Так, за даними С. А. Анатолія (1969), вірулентність штамів корелювала з продукцією бета-гемолізини, летального фактора, лецітовітеллази, гіалуронідази і коагулазу. А. К. Акатов (1968) не зазначає кореляції вірулентності з коагулазной, леціговітел-Лазні, фібринолітичної активністю, не встановлена кореляція з дельта-токсигенних.

Для порівняння вірулентності стафілококових культур можна використовувати їх здатність викликати дермонекротіческую реакцію у кроліков.Готовят 4-мільярдну суспензію добової агарної культури стафілокока в фізіологічному розчині, а з отриманої густоти роблять розведення, щоб отримати 2 і 1-мільярдні суспензії. З кожного розведення в об`ємі 0,1 мл, що становить 100, 200, 400 мільйонів мікробних тіл, вводять кролику в вистріженную або депілірованних напередодні шкіру. На одному кролика можна одночасно поставити до 8 внутрішньошкірних проб. Щодня відзначають прояви дермонекротіческой реакції, а остаточно на 4-у добу. За мінімальну дермонекротіческую дозу приймають то найменшу кількість культури, яке дає некроз на 4-у добу (Г. В. Вигодчіков, 1963).

Список використаної літератури

• А.М.Смірнова, А.А.Трояшкін, Е.М.Падеріна: мікробіологія та профілактика стафілококових інфекцій - «Медицина», 1977.
• Стафілококові інфекції: російський зб. науч. тр. - С.-П., 1991.
• А.М.Смірнова: питання імунології та мікробіології стафілококових і стрептококових інфекцій - Ленінград, 1975.

Відео: Олена Малишева. Симптоми і лікування стафілокока