Стафілококові інфекції

Незважаючи на те, чтостафілококкі належать до числа найбільш легко виявляються і распознаваемихмікроорганізмов, які не потребують складних діагностичних прийомів для їх виявлення, в практичній роботі мікробіологи досі відчувають певні трудностіпрі встановленні їх причинного ролі в ряді різних захворювань. З одногобоку, присутність патогенних стафілококів, що виявляється в ісследуемомматеріале, не завжди є переконливим доказом їх етіологіческогозначенія. З іншого, з огляду на велику різноманітність проявів біологіческойактівності цих мікробів, залежне від різних, не завжди піддаються учетуфакторов, широку їх мінливість під впливом лікарських речовин і самогомакроорганізма, досить складно буває визначити їх потенційну патогенность.Наконец, третя причина пов`язана з тим, що стафілококи є представітелямінормальной мікрофлори з групи умовно патогенних мікроорганізмів і, поряд снепатогеннимі, патогенні представники мешкають в організмі людей, распространяяс ь при цьому вельми нерівномірно на різні ділянки человеческоготела.

Якщо виділення патогенногостафілококка, з крові хворих людей і різних порожнин, які прийнятовважати стерильними, в переважній більшості випадків може служітьдоказательством його ролі як збудника хвороби, то присутність стафілококковна слизових зіву, носа і т. Д. Навіть при явному хворобливому стані їх требуетбольшой обережності дослідника в висновках про етіологію даннихзаболеваній.

Тому, природно, неможе бути загальних рекомендацій, як при діагностиці різних стафілококковихінфекцій, так і при мікробіологічних дослідженнях ділянок тіла людини іразних об`єктів зовнішнього середовища. Широкий обмін думками між мікробіологамінаучних установ і практичних лабораторій, здійснюваний на з`їздах іконференціях, присвячених проблемам стафілококових інфекцій, а також при лічнихконтактах, здавалося б, повинен був привести до певних поглядів на разлічниеметоди дослідження, пропоновані для виділення та ідентифікації стафілококков.Однако велике число запитів, надходять з лабораторій СЕС і лечебнихучрежденій, свідчить про явні труднощі, які виникають уісследователей при вирішенні різних пи осов мікробіологічної діагностікістафілококков, а в ряді мікробіологічних установ існують ще некоториеустаревшіе методи і прийоми, що призводять до неправильних оцінок і навіть досаднимнедоразуменіям.

Важливим условіемеффектівності лабораторної діагностики є поєднане определеніекачественних і кількісних критеріїв змісту патогенних стафілококів вісследуемом матеріалі. Виходячи з цього, я вважаю за необхідне викласти рядметодов основних мікробіологічних досліджень, найбільш простих і доступнихдля кожної практичної та наукової лабораторії, якими ми користуємося в теченіемногіх років.

Основні принципи ВИЯВЛЕННЯ І ІДЕНТИФІКАЦІЇ стафілокок

Попередня діагностікастафілококков може грунтуватися на бактеріоскопічному вивченні препаратів -мазков, забарвлених по Граму. Патогенні стафілококи, крім гроздевідногорасположенія, характеризуються правильної сферичної формою клітин. Обнаруженіестафілококков, що знаходяться всередині клітин, дозволяє дати відповідь про налічіістафілококковой інфекції. У більшості ж випадків для точного установленіяпатогенності виявлених стафілококів потрібно виділити ці мікроорганізми начисто культурі шляхом посіву досліджуваного матеріалу на щільні пітательниесреди.

В даний времяассортімент диференціальних, елективних і накопичувальних середовищ, запропонованих длявиделенія патогенних стафілококів, досить значний і продовжує расшіряться.Многіе дослідники на основі знання основних біохімічних характеристик іпітательних потреб патогенних стафілококів при конструюванні средстремятся підвищити їх висеваемость і забезпечити можливість здійснювати іхколічественний облік, отримати надійний спосіб відрізняти потенціальноболезнетворние стафілококи від сапрофітів.

Вживання жідкіхнакопітельних середовищ для первинного виділення стафілококів недоцільно, таккак позбавляє дослідника можливості кількісної оцінки змісту мікробів вобследуемих об`єктах, а при випадкових забрудненнях сприяє ошібкам.Особенно це відноситься до таких досліджень, як виявлення носітельствапатогенних стафілококів, де доказом є лише масивний ріст, лібоопределеніе етіологічної ролі цих мікроорганізмів "при харчових отравленіяхілі зовнішніх запальних процесах. Якщо ж реч ь йде про дослідження крові, а також про тих небагатьох випадках, коли буває необхідно виявити навіть едінічниежізнеспособние особини цих мікробів, наприклад при контролі еффектівностідезінфекціі, перевірці на стерильність або тітраціонних посівах, то в подобнихслучаях використання накопичувальних середовищ цілком виправдано.

З великого чісларазнообразних поживних середовищ, випробуваних для первинного виделеніястафілококков, в практиці виправдав, -1 "себе не всі. Звичайний живильний агар (рН 7,2 7,4), приготований шляхом додавання 2% агар-агару до мясопептонномубульону або до триптичного переварити Хоттингера, може бути використаний придослідженні ексудатів з закритих порожнин. Стафілококи виростають через 18-24ч інкубації при 37 ° с у вигляді гладких блискучих з рівними краями непрозорих іслегка опуклих колоній. Характер пігменту виявляється краще последополні Єльня добового витримування чашок при кімнатній температурі (20 ° С) на світлі. Якщо в досліджуваному матеріалі присутній стороння флора, то повнешнему увазі колонії стафілококів можуть бути важко відрізнити.

Вживання кров`яного агарадает можливість, крім виявлення пігменту, визначити і гемолітіческуюактівность стафілококів. При цьому необхідно пам`ятати, що гемолітіческаяспособность, яка визначається на чашках з кров`яним агаром, залежить від багатьохфакторів - виду крові, її концентрації, наявності в ній антитоксинів, товщини слоясреди, вмісту вуглекислого газу в атмосфері культивування, густоти посіву, присутності і характеру супутньої флори і т . д.

При відборі колоній скровяного агару необхідно отвівают як гемолітичні, так і не дающіегемоліза, особливо якщо дослідження проводиться на середовищі з людською ілілошадіной кров`ю, а відсутність гемолізу на таких середовищах не дозволяє заключітьоб відсутності взагалі гемолітичної активності. Тому використання кровяногоагара для первинного посіву доцільно тільки при обстеженні об`єктів, несодержащей сторонньої мікрофлори, і бажано додавати в живильне средукровь кролика або барана.

Якщо ж проводітсяісследованіе гною відкритих ран або відокремлюваного виразок або нориць, то следуетпользоваться елективних-диференціальної середовищем для стафілококів -желточно-сольовим агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Елективних цієї средиобеспечівается високим вмістом хлористого натрію, а доданий яічнийжелток дозволяє виявляти лецітовітеллазной активність, яка є однимз показників патогенності стафілококів і в силу цього ЖСА більш четкодіфференцірует патогенних представників, ніж кров`яний агар. Приготування ЖСАнесложно.

Заготовляють про запас істерілізуют в автоклаві при 120 ° С "протягом 20 хв поживний агар (МПА іліХоттінгера) рН 7,2-7,4, що містить 10% кухонної солі. Перед употребленіемсолевой живильний агар розтоплюють, остуджують до 45-50 ° С і додають до нему20% за обсягом стерильною желточной суспензії (1 жовток курячого яйця на 200 млфізіологіческого розчину). Для кращого емульсірованія бажано мати колби состекляннимі намистом. Після ретельного перемішування середовище розливають по 20-25 МЛВ чашки, які можуть зберігатися в холодильнику протягом несколькіхдней.

Слід проізводітьмассівний посів досліджуваного матеріалу на чашки з ЖСА, а інкубацію вести напротязі 2 діб при 35-37 ° С. Стороння флора різко пригнічується, стафілококкіже на ЖСА виростають практично в чистій культурі. Безпосередньо при просмотречашек навколо колоній відзначається утворення райдужних віночків і каламутній зони -лецітовітеллазная реакція. Такі колонії, не менше двох з кожного посіву, отвівают на скошений м`ясо-пептони агар для подальшої перевірки виросшіхкультур в реакції плазмо-коагуляції.

Щоб уникнути помилок ввизначенні желточной реакції, необхідно мати на увазі, що іноді наблюдаетсяпомутненіе середовища без веселкового обідка, в цьому випадку проба на лецітовітеллазусчітается негативною. Якщо ж колонії, що виросли на ЖСА, що не даютлецітовітеллазной реакції, т. Е. Оточені райдужним віночком, але є ростстафілококков, то їх теж вважають підозрілими і також отвівают не менше двухіз кожного такого посіву на чашки з простим живильним агаром плямами діаметром5-10 мм . Після добового інкубації при 37 ° С отримані макроколонііпроверяют в реакції плазмоагглютінаціі, для чого мікробну масу размешіваютпетлей на склі в краплях цитратной кролячій або людської плазми, розведеною 1: 4. Освіта пластівців враховують протягом 30с-1 хв. При налічііплазмоагглютінаціі такі штами вважають підозрілими і отвівают на скошеннийагар для подальшого вивчення в коагулазной реакції. При такому відборі чіслопропускаемих штамів патогенних стафілококів людського проісхожденіяневеліко, культури же, виділені від тварин, потрібно перевіряти в реакцііплазмокоагуляціі.

Коагулазной проба єосновним ознакою, визначальним хвороботворність стафілококів, тому еепостановка вимагає до себе максимальної уваги. Для виявлення коагулазнойактівності у стафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цельнойкровью, так і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров іліплазму, взяту безпосередньо від людини. Консервована плазма або кров, що використовуються для переливання, непридатні для реакції, так як до них частодобавляются консерванти, які перешкоджають життєдіяльності стафілококів, прояву коагулазной активності. Не слід застосовувати кров тварин ілілюдей, що переносять стафілококові захворювання, особливо затяжні, так какони може виявитися нестерильний і містити антікоагулазу. При роботі состафілококкамі, виділеними від рогатої худоби, можна користуватися бичьейкровью.

Асептично взяту кровьстабілізіруют за допомогою 1-4% цитрату або 0,1% оксалату. Для отримання плазминітратную кров центрифугують або відстоюють на холоду. Але, як вже говорилося, можна користуватися і цілісною кров`ю. Потім кров розводять стерільнимфізіологіческім розчином в співвідношенні 1: 3 або 1: 5 і розливають по 0,2-0,3мл в стерильні пробірки, які перед стерилізацією повинні бути тщательновимити, так як залишки хімічних речовин можуть впливати на результатплазмокоагуляціі.

Випробовувані агарові культуристафілококков вносять петлею в плазму і добре перемішують. Бульйонні культуривносят піпеткою в обсязі 0,1 мл У кожному досвіді необхідно ставити контроль скультурамі свідомо патогенних стафілококів, що дають коагулазной реакцію, іштаммамі коагулазоотріцатель-них мікроорганізмів. Крім того, частина пробірок сразлітой плазмою слід залишати не засіяної мікробами і витримувати втермостате протягом усього терміну досвіду. У разі настання коагуляції хоча б в одній з них весь досвід потрібно переставити з новою порцією крові. Пробірки сісследуемимі культурами витримують в термостаті при 37 ° С протягом доби. Учетрезультатов проводиться обов`язково двічі: через 2-3 год і 24 ч. Учітиваютсвертиваніе плазми і утворення згустків. Зазвичай культури, актівнопродуцірующіе коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 ч. А якщо оніобладают і вираженою фібринолітичної активністю, то первоначальнообразовавшіеся згустки можуть піддатися розплавлення до кінця суток.Слабокоагулірующіе штами можуть давати позитивну реакцію в пізні терміни-докінця діб. Досліди, що дали сумнівний результат, необхідно повторити.

Деякі дослідники, отримавши негативний або сумнівний результат, залишають пробірки на столе.Етого робити не можна, так як згортання плазми в більш пізні терміни можетносіть НЕ специфічний характер і його не слід брати до уваги.

Стафілококи, дающіеположітельную коагулазной пробу, повинні розглядатися як потенціальнопатогенние, незалежно від наявності або відсутності у них гемолітичних властивостей іхарактера пігменту, їх відносять до виду St. aureus і надалі подвергаютфаготіпізаціі і перевірці на чутливість до антибіотиків.

Поглиблене ізученіестафілококков показало, що основна ознака па-тогенності - коагулазной реакціяможет піддаватися мінливості при впливі різних факторів (Г. Н.Чістовіч, 1961- Е. М. Падеріна, 1966), тому в ряді випадків, при виделеніікоагулазонегатівних стафілококів в монокультурі з патологічних вогнищ , доцільно вивчити у них інші ознаки потенційної хвороботворності іпрежде всього - здатність ферментувати маніт в анаеробних условіях.Ізвестно, що серед коагулазоотріцательних частина культур має спосо ностьюрасщеплять маннит в анаеробних умовах (8,4% -за даними А. А. Акатова і М. Л.Хатеневер, 1974).

Визначення ферментацііманніта в анаеробних умовах технічно дуже просто і здійснюється путемпосева уколом досліджуваних культур в пробірки з високим стовпчиком полужідкогоагара Хоттннгера, що містить 1% маніту і 0,004% індикатора бромкрезолпурпураілі бромтимолблау (рН == 7,2). Цієї середи перед посівом "регенерують", т. Е.кіпятят в водяній бані, швидко охолоджують, а після посіву заливають слоемстерільного вазелінового масла. Посіви інкубують при 37 ° С протягом 5 дней.Однако в значній кількості випадків результати можуть бути враховані вже черезсуткі.

Поряд з реакціейплазмокоагуляціі, велике значення набула ще одна важлива способностьстафілококков, що характеризує їх потенційну патогенність, -дезоксірібонуклеазная активність. Багато дослідників повідомляють про високойкорреляціі цієї ознаки з коагулазной активністю і токсигенних ізучаемихкультур- відзначають, що стафілококи, виділені з патологічного матеріалу, як правило, мають ДНК-азой. Коагулят-зопозітівние штами, отримані відносний, можуть не мати цього ферменту, і зазвичай отсутствіедезоксірібонуклеазной активності поєднується з низькою біохімічної способностьюі атоксігенностью таких культур стафілококів.

За спостереженнями некоторихісследователей, серед коагулазонегатівних штамів стафілококів, але обладавшіхдругімі ознаками патогенності, виділених у ряді випадків від хворих зрізними гнійними інфекціями, дезоксірібонуклеазную активність проявляли від 10до 29% таких культур (І. І. Панишева і співр., 1967- Franklin і співавт., 1966 Lierd і Golde, 1970).

В даний час цей тестможет служити надійним диференціальних ознакою між патогенними інепатогеннимі стафілококами і в той же час може допомогти в діфференціаціістепені патогенності коагулазопозітівних штамів і, безумовно, прівлечетвніманіе до коагулазонегатівних, але володіє цим ферментом культурамстафілококков і в ряді випадків дозволить віднести останні до болезнетворнимформам з більшою впевненістю .

Методика определеніядезоксірібонуклеазной активності нескладна, в основу її покладено метод Джеффріса.Готовят про запас 2% МПА (рН-8,6), що містить ДНК (2 мг / мл середовища), розливають пофлаконам і стерилізують текучою парою протягом 30 хв. Перед розливом в чашки ксреде додають CaCIa (0,8 мг / мл). На підсушену середу засівають суточниекультури стафілококів. Після інкубації протягом 18-20 год при 37 °, на поверхню середовища наливають IN розчин НС1 і через 7-10 хв враховують зонипросветленія, які оцінюють хрестами (Н. Б. Мордвинова і співавт., 1967).

Нами запропонований болееекономічний метод для виявлення ДНК-ази у мікроорганізмів. Цей спосіб, помімоуменьшенія в 2 рази витрати ДНК на кожен досвід, дозволяє використовувати болеедешевую нізкополімерной нуклеїнових кислот, виготовлену Олайнського заводомхіміческіх реактивів. Пропонована методика широко апробована на кафедремікробіологіі ЛСГМІ і за якістю результатів не поступається загальноприйнятою. Поетомуми наводимо її докладний опис.

Для приготування рабочегораствора ДНК, навішення нуклеїнової кислоти з розрахунку 10 мг / мл поміщають вдістіллірованную воду, додають 0,5 мл 0,2% (або 0,8%) розчину NaOH на каждие10 мл води. Для кращого розчинення ДНК суміш або нагрівають до кипіння вводяной бані при постійному перемішуванні скляною паличкою, або залишають наніч при 37 ° С в термостаті. До розплавленого і охолоджений до 50 ° С МПАдобавляют робочий розчин ДНК з розрахунку 1 мг / мл (на 9 мл МПА-1 мл раствораДНК), перемішують, розливають по10л (л в пробірки, стерилізують текучою парою напротязі 30 хв або в автоклаві при 0, 5 атмосфери протягом 20 хв. Срокхраненія- 1-2 міс.

При постановці опитастолбікі агару з ДНК розтоплюють, на водяній бані додають 0,1 мл офіцінальногостерільного 10% р-ра СаСЬ, перемішують і виливають на шар добре подсушенногопітательного агару в чашки Петрі і знову підсушують. Добову агарове культурузасевают маленькими бляшками (діаметр дорівнює 2-2,5 мм) або штампом-реплікаторомне більше 20-25 бляшок, щоб уникнути злиття зон деполімеризації ДНК. После18-20-годинної інкубації поверхню агару заливають 5 мл IN розчину НС1 і через3-5 хв враховують зони просвітління. Реакції оцінюють в хрестах.

При цьому слід врахувати, чтоінтенсівность зони деполімеризації на щільному середовищі не завжди збігається сколічеством продукції цього ферменту у досліджуваних стафілококів в жідкіхсредах.

Для обнаруженіяфібрінолізіна використовують кілька вдосконалений метод Крісті ССОТР.

Середа Крісті-Чепмена імеетследующій склад: м`ясний екстракт-0,45 г, пептони-0,75 г, хлористий натрій-1,2 г, агар-2,75 г, вода-130 мл, рН середовища == 7,0. Стерилізується в автоклаві ісохраняется про запас.

Перед досвідом средурастаплівают, остуджують до 50 ° С і додають 15-20% стерильною цітратнойчеловеческой плазми. Суміш прогрівається в водяній бані при 65-70 ° С протягом 2-5 хв до появи ясною каламуті, а потім розливається в чашки. Випробовувані культуризасевают "плямами" по 15-20 на чашку. Посіви інкубують при 37 ° С. Учітиваетсяобразованіе зон просвітління навколо колонії спочатку через 14 год, затемчерез 24 і 48 ч, так як реакція у різних культур тече неоднаково швидко иу ряду штамів вона розвивається в більш пізні терміни.

Фібринолітичний тест мисчітаем вельми придатним для визначення потенційної болезнетворностістафілококков, але оцінюємо тільки в комплексі з іншими прізнакаміактівності.

Гіалуронідазну актівностьопределяется за методом Мак-Клину в модифікації М. Ш. Могильовського і Л. С. Коган (1949).

Розчин гиалуроната дає в присутності 2 N оцтової кислоти типовий згусток, розливається по 0,5 мл встерільние пробірки. Додається 0,5 мл добової культури стафілокока впептонной воді. Контролями служать: гіалуропат + дистильована вода ігіалуропат + незасіяні середу. Суміші встряхиваются і витримуються при 37 ° С15-20 хв. Потім в кожну пробірку додається по дві краплі 2 N растворауксусной кислоти і струшується. В контролях повинен утворитися слізістийкомочек. Під час експерименту при наявності гіалуронідази він відсутній, що свідчить одеполімерізаціі гіалуронової кислоти мікробним ферментом.

Для вивчення токсігенностістафілококков зручно користуватися методом, запропонованим Илеко і Леві (1950), що дозволяє визначити типи гемолізинів.

З цією метою готуються чашкіс живильним агаром, що містить 5% відмитих фізіологічним растворомерітроцітов барана, кролика і людини.

На поверхню пітательнойсреди по діаметру поміщають стерильну смужку фільтрувального паперу, смоченнуюальфа-антитоксичної сироваткою. Відступивши 1-2 мл від краю смужки, перпендикулярно до неї засівають штрихами досліджувані культури. Посіви інкубіруютпрі 37 ° С протягом доби, після чого враховують результати.

Альфа-гемоліз проявляється у вигляді повного просвітління середовища навколо штриха культури і нейтралізуетсяальфа-антитоксичної сироваткою. Він виявляється на середовищах з кролячими ібараньімі еритроцитами

Бета-гемоліз на агарі сбараньей кров`ю дає часткове просвітлення, зона якого імеетбуровато-пурпурний відтінок. Це "тепло-холодовий" токсин і краще виявляетсяпосле додаткового добового витримування чашок в холодильнику притемпературі +4 ° С по характерному пошаровому гемолизу баранячих еритроцитів і нецентралізуется альфа-антитоксичної сироваткою. На кролячих еритроцитах він неактивний. Дельта-гемолізини визначається по вузькій смужці гемолізу баранячих ікролічьіх еритроцитів, що не нейтралізується альфа-антитоксичної сивороткой.Однако освіту дельта-гемоли-зина на цих чашках може бути замаскірованодействіем альфа-токсину і тому його слід перевіряти на середовищах з ерітроцітамічеловека або коні. Таким чином, для визначення всіх 3 типів гемолізіновдостаточно використовувати еритроцити барана і людини або коня.

Для определеніявірулентності стафілококів існують кілька різних методів зараженіябелих мишей.

Найбільш простим являетсявведеніе 0,1 мл добової бульонной культури випробуваного стафілокока в хвостовуювену. Облік загибелі тварин здійснюється протягом 10 діб, регістріруютналічіе абсцесів в нирках.

Зручно користуватися способомBadenski і співр. (1958), Добова бульйонна культура центрифугируется при 3000об / хв - 30 хв. Отриманий осад ресуспендіруєтся в половинному об`емедекантата і в кількості 0,05 мл вводиться 6 мишам позаду очного яблука вокологлазнічную клітковину. Культуру, яка викликає загибель половини і болеезараженних мишей протягом 6 днів, вважають вирулентной.

При цих методах зараженіявірулентной культурою у тварин розвивається громад септичний процес спреімущественним ураженням нирок. Основна загибель мишеі відбувається на 3-5-й день після зараження.

Інші способи зараженіябелих мишей (внутрішньочеревно і інтраназальний) вимагають в десятки

разів більшою заражає дози, максимум загибелі мишей доводиться на 1-2-е добу, що характерізуетпреімущественно токсичний компонент процесу (С. А. Анатолій, І. І.Антоновская, 1967).

У той же час рядісследователей віддають перевагу більш простому технічно внутрібрюшінномуспособу зараження мишей, який одночасно дозволяє вивчати клітинні ігуморальние механізми розвитку інфекції.

Зіставлення вірулентностістафілококков для білих мишей з окремими факторами їх патогенності показало, що вірулентність штамів, за даними великої кількості дослідників, корреліруетс рівнем альфа-гемотоксини. Що стосується інших ознак патогенності і іхкорреляціі з вірулентністю, то отримані суперечливі відомості. Так, по даннимС. А. Анатолія (1969), вірулентність штамів корелювала з продукціейбета-гемолизина, летального фактора, лецітовітеллази, гіалуронідази і коагулази.А. К. Акатов (1968) не зазначає кореляції вірулентності з коагулазной, леціговітел-Лазні, фібринолітичної активністю, не встановлена кореляція сдельта-токсигенних.

Для порівняння вірулентностістафілококкових культур можна використовувати їх здатність визиватьдермонекротіческую реакцію у кроликів.

Готують 4-мільярдну взвесьсуточной агарної культури стафілокока в фізіологічному розчині, а ізполученной густоти роблять розведення, щоб отримати 2 і 1-мільярдні взвесі.Із кожного розведення в об`ємі 0,1 мл, що становить 100, 200, 400 мілліоновмікробних тел, вводять кролику в вистріженную або депілірованних напередодні кожу.На одному кролику можна одночасно поставити до 8 внутрішньошкірних проб. Ежедневноотмечают прояви дермонекротіческой реакції, а остаточно на 4-у добу. Замінімальную дермонекротіческую дозу приймають то найменшу кількість культури, яке дає некроз на 4-у добу (Г. В. Вигодчіков, 1963).

Список використаної літератури

• А.М.Смірнова, А.А.Трояшкін, Е.М.Падеріна: мікробіологія та профілактика стафілококових інфекцій - "Медицина", 1977.
• Стафілококові інфекції: російський зб. науч. тр. - С.-П., 1991.
• А.М.Смірнова: вопросиіммунологіі і мікробіології стафілококових і стрептококових інфекцій -Ленінград, 1975.