Експрес - діагностика особливо небезпечних інфекцій

Актуальність проблеми

Особливо небезпечні інфекції (ГОІ) - це інфекції, які можуть виникати серед населення у вигляді отдельнихзаболеваній, епідемій і навіть пандемій, частіше супроводжуючи НС (стихійні лиха, війни, масовий голод і т.п.), що характеризуються природною осередкових, бистримраспространеніем і тяжким перебігом .

Єдиного в усьому світі мненіяо те, які інфекції слід зараховувати до ГОІ поки немає, отечественниеепідеміологі дотримуються такого переліку:

• чума
• туляремія
• Міелоідоз
• геморагічні лихоманки
• Жовта лихоманка
• холера
• Генералізована форма сибірської виразки

Відео: Особливо небезпечні інфекції (Частина 1)

Найбільш ймовірне появленіеООІ можливо під час НС. Різке погіршення санітарно-гігієнічних условійобостряет епідемічну ситуацію по інфекцій, які раніше мали ендеміческіххарактер, а завезенихінфекції ззовні прибувають особами призводить до того, чтопотенціальние джерела інфекції виявляються неізольованими і в теченіедлітельного часу мають численні контакти з оточуючими їх особами. У зв`язку з цим до встановлення остаточного діагнозу захворювання соблюдаетсястрогій протиепідемічний режим. При перших ознаках або підозрі на ООІосуществляется:

• Виявлення контактних осіб та їх обсервація
• Дача антибіотиків широкого спектру дії (доксіцілін, тетрациклін та ін.), Тобто екстрена профілактика
• Проведення дезінфекційних заходів
• Відбір матеріалу від хворих і доставка його в лабораторію для мікробіологічного дослідження
• Організація часткової (повної) санобробки конкретних осіб

У даній роботі разбіраетсяетап діагностики ГОІ на прикладі чуми, холери та туляремії. Якщо діагнозустановлен з достатньою достовірністю, можна визначити характерпротівоепідеміческіх заходів, встановити можливе джерело інфекції і механізмів його передачі. Саме з цього необхідно і виправдано прімененіеекспресс-методів діагностики ГОІ.

Загальні принципи експрес-діагностики станів інфекції та імунітету

Сучасна іммунологіяісключітельно багатолика, а сфери застосування імунологічних знань і методовбеспредельно різноманітні. Вони використовуються практично у всіх разделахбіологіі, ветеринарії і медицини - від фундаментальних молекулярно-біологіческіхісследованіі до медико-генетичного консультування і безлічі інших сугубопрактіческіх процедур, що здійснюються рослинникам, тваринниками імедікамі.

І, тим не менш, особенноважним в соціальному відношенні і методично найбільш передовим продовжує битьтот найстаріший і неухильно розвивається розділ імунології, успіхами которогообеспечівается розвиток теорії і здійснення практики протівоепідеміческойработи-діагностики, профілактики та лікування інфекційних захворювань. А методиіммунологіческой експрес-діагностики мають ключове значення для еффектівногорешенія названих проблем та здійснення усіх соответствующіхпротівоепідеміческіх заходів. Наступні нижче матеріали і присвячені іменноетому розділу прикладної імунології, його станом і перспектівамразвітія.

Найважливішою предпосилкойеффектівності будь-яких протиепідемічних заходів є своевременноепрогнозірованіе і виявлення моментів активізації тих екологічних та соціально-екологічних взаємодій, які становлять существоепідеміческіх процесів. Виключне різноманітність, властиве останнім ітребующее диференціації протиепідемічних заходів, обумовлене не толькосамобитностью кожної з існуючого безлічі інфекційних хвороб. Дужевеликих значення має в цьому відношенні фундаментальне явище гетерогенностіпопуляцій, що входять до складу відповідних екологічних та соціально-екологічних систем мікроб-жертва. Варіабільность цих вельми сложнихбіосоціальних факторів і умов в дуже великій мірі впливає на специфіку того іншого етапу існування кожного епідемічного процесу. І своевременноераспознаваніе цих особливостей, здійснюване, як правило, з іспользованіеміммунологіческіх методів, забезпечує ту диференціацію протівоепідеміческіхмеропріятій, завдяки якій досягається відповідний баланс їх ефективність виправданості.

Активізація епідеміческіхпроцессов визначається, перш за все, зміною співвідношень між двумяосновнимі параметрами екологічних систем мікроб-жертва, а "саме междуболезнетворнимі потенціями збудників відповідних інфекцій ііммунологіческій статусом загрозливих контингентів в цілому і кожного з них членовв окремо. Співвідношення між цими параметрами визначають терміни іінтенсівность активізації епідемічних процесів, а отже обсяг іхарактер протиепідемічних заходів. Стан же цих параметрів ісоотношенія між ними характеризуються головним чином з помощьюіммуно-діагностичних методів, що дозволяють оцінювати стану інфікованості імунної, як індивідуумів, так і колективів. Цілком зрозуміло, чтонаибольшие цінність мають експресні методи иммунодиагностики.

Імунологічні методиекспресс-діагностики станів інфекції та імунітету в деяких отношеніяхпрінціпіально різні, але в багатьох інших аспектах вони є практіческіедінимі.

Методи експрес-діагностікіінфекціонних захворювань до недавнього часу розвивалися головним чином наоснове класичних схем мікробіологічного аналізу, який зводиться квиделенію в чистій культурі збудника і подальшої його ідентифікації побіохіміческім, тинкторіальними, антигенними та іншим характерним свойствам.Многоетапность цих аналізів обумовлює їх тривалість і практіческіісключает експресному, що задовольняє епідеміологічну і клініческуюпрактіку. Тривалість мікробіологічного аналізу становить, як мінімум, кілька днів.

Експрес-індикація - етосвоеобразная розвідка великої армії лабораторної діагностики. Вона знаходиться на передній краї наукового пошуку нових, простих, економічних, швидких методовіндікаціі мікробів, частина з яких в подальшому йде на вооруженіелабораторной практики і завдяки цьому остання весь час вдосконалюється.

Основні об`ектівниетребованія до експресним методам діагностики інфекційних захворювань зводяться донаступного:

• отримання результатованаліза в максимально короткі терміни (години, ідеально-хвилини) -
• можливість проведення і завершення аналізу без виділення шуканого мікроорганізму в чистій культурі, прііспользованіі тільки нативного матеріалу, в крайньому випадку-з прівлеченіемелектівних біосередовищ для швидкого накопичення возбудітелей-
• безперечно високаяспеціфічность і висока чутливість, як передумови надлежащейдостоверності аналізу-
• високаяпроізводітельность, простота, доступність і відтворюваність аналізів. Етітребованія в рівній мірі застосовні і до методів експресному діагностики состоянійіммунітета.

Предпочтітельностьіспользованія того чи іншого з існуючих методів експрес-діагностікізавісіт від багатьох конкретних умов. Однак найбільш бажаним являетсяпараллельное використання 2-3 методів. Такий підхід значно увелічіваетнадежность одержуваного результату.

На найближчі роки наіболееперспектівнимі наступні напрямки розвитку експрес-індікаціімікроорганізмов.

1. Ензімоіндікаціонноенаправленіе, пов`язане з експрес-індикацією біохімічних властивостей іопределеніем ферментативного спектру мікробів.

Як і раніше збережуть своюзначімость дослідження з розробки Політропний (полісубстратних) пітательнихсред. У нашій країні були розроблені оригінальні Політропний середовища і іхкомбінаціі, які з успіхом застосовуються в лабораторній практиці.

При створенні сложнихполікомпонентних поживних систем необхідно виходити з разлічнихбіохіміческіх і енергетичних потреб мікроорганізмів. Для лучшегопроявленія життєдіяльності та біохімічної активності патогенних і другіхмікробов в середовищах необхідно створювати оптимальні умови для їх росту іразмноженія і одночасно вводити ферментіруемие субстрати (вуглеводи, багатоатомні спирти, амінокислоти та ін.) З найбільш чувствітельнимііндікаторамі, які швидко б реєстрували їх ферментацію. У результатепрімененія оптимальних полісубстратних середовищ проводиться виділення і накопленіечістой культури мікробів з одночасним визначенням їх біохіміческіхпрізнаков.

Перспективним слідрозглядати розвиток ензімоіндікаціонних методів, в яких субстрат сіндікатором відділений від живильного середовища і фіксований на спеціальному носії. Унашій країні розроблені вуглеводно-паперові диски із захисною плівкою (бумажниереагенти для визначення дезамінази у мікробів) і їх аналоги БІС (паперово-індикаторні системи), вуглеводно-паперові поплавці, вуглеводно-полімерні плівки. Всі ці препарати є дуже перспективними, вони дозволяють за найкоротший час (3-5 год), використовуючи общепрінятиепітательние середовища і лабораторний посуд, визначати ферментативну актівностьразлічних видів мікроорганізмів.

Автономний препарат -карандаш-фермент, який не має аналогів ні у нас, ні за кордоном, дозволяє безпрімененія поживних середовищ безпосередньо на предметному склі определятьбіохіміческіе властивості мікробів.

Полісубстратная тест-сістемаа ензімоіндікаторная стрічка використовуються для одночасної ідентифікації 20біохіміческіх ознак у мікробів. Це нові види простих "довгожителів" препаратів, призначених для швидкого й економічного определеніябіохіміческіх властивостей мікробів.

Електрофізичний методопределенія ферментативної активності мікробів включає посів мікробної культурина рідкі поживні середовища, що містять пептони воду, різні вуглеводи, багатоатомні спирти, амінокислоти з подальшим ферментативним расщепленіемісследуемих речовин і утворенням різних іонізованих продуктів розпаду, які виявляються спеціальної електронної апаратурою. Результати ензімоіндікаціірегістріруются через 45-60 хв з моменту посіву матеріалу. Метод позволяетобнаружіть і ідентифікувати кінцеві продукти розпаду, тобто конечниемотаболіти з визначенням їх біохімічної та хімічної природи. Безумовно, електрофізичний метод заслуговує пильної уваги і потребує вдальнейшем вивченні і доопрацювання.

2. Іммунологіческоенаправленіе, пов`язане з швидким визначенням як окремих спеціфіческіхдетермінант, так і з індикацією цілих антигенних груп і комплексів, що характеризують пологи, види і серовар бактерій. До власне іммунологіческомунаправленію ми відносимо класичні імунологічні методи, засновані навикористанні природних реагентів. Реакції преципітації в рідини по Асколі в гелі по Оухтерлоні і Манчіні (особливо їх мікроваріант) зберігають своезначеніе як методи експрес-індикації патогенних мікробів і виявлення іхантігенов в різних матеріалах.

Перспективними являютсярапід-системи для одночасної і швидкої індикації різних відовмікроорганізмов в реакціях мікроаглютинації, хоча як і раніше не вирішені вопросисозданія оптимальних видів і найбільш економічних форм таких сістем.Іммунологіческіе принципи розпізнавання антигенів є вельми тонкими, специфічними, чутливими, з великими Індикаційна-діагностіческімівозможностямі. Комплексирование імунологічних принципів з фізичними, хімічними і деякими іншими принципами сприяло діфференціаціііммунологіческого направлення на ряд самостійних напрямів, коториепріводятся нижче.

3. Іммунофізіческоенаправленіе, що використовує різні за своєю природою, формою і величиною відимелкодісперсних носіїв (сорбентів) антигенів і антитіл, способствующіхповишенію чутливості комплексних імунологічних методів.

Реакції пассівнойгемагглютінаціі і їх модифікації пов`язані з використанням ерітроцітарнихдіагностіческіх препаратів. Еритроцитарної діагностику з успіхом застосовуються дляускоренного виявлення та ідентифікації як патогенних, так і умовно-патогеннихмікроорганізмов (наприклад, збудників туляремії, бруцельозу, сальмонельозу та ін.) В різних патологічних матеріалах, отриманих від хворих, і в об`ектахвнешней середовища. Реакції з еритроцитарних діагностикумами є весьмачувствітельнимі, і в цьому відношенні часто перевершують інші серологіческіереакціі. Вони введені в офіційні інструкції по експрес-індікаціібактеріальних агентів в елементах зовнішнього середовища і в матеріалах, отриманих отпораженних людей і тварин.

Одночасно продолжаютсяпоіскі нових носіїв антигенів і антитіл, які були б безантігеннимі, стабільними, що не руйнуються при тривалому зберіганні, а застосовувані реакції -Пробач по техніці постановки (наприклад, скляні тести) і дослідження з іхпомощью - економічними.

Удосконалюються реакції ззастосуванням кольорових целюлозних частинок як носіїв антигенів і антітел.Положітельнимі властивостями такого роду препаратів є:

• отсутствіесобственной антигенности
• стабільність при тривалому зберіганні
• демонстративність і простота техніки постановки реакції, зазвичай на предметномстекле
• висока швидкість проходження реакції
• економічність

Відео: Основні хвороби цивілізації (цикл лекцій з донозологіі)

Крім того, корисним іоправданним вважаємо пошук нових носіїв антигенів і антитіл. У цьому отношенііперспектівнимі є іонообмінні смоли, латекси, целюлоза і її проізводниеі ряд інших речовин, які можуть сприяти підвищенню чувствітельностісерологіческіх реакцій.

4. Іммунохіміческоенаправленіе, пов`язане з використанням різноманітних комплексних соедіненійспеціфіческіх антитіл або антигенів з хімічними речовинами. Прісоедіненниехіміческіе речовини надають їм нові феноменологічні здібності та властивості, тим самим, розширюючи можливості експрес-індикації мікробних агентів зокрема лабораторного аналізу взагалі.

Велику популярність і практично значимість придбали методи швидкого імунофлуоресцентного аналізу (прямий, непрямий, антікомплементарний), які нині офіційно іспользуютсякак методи експресному індикації і швидкого визначення мікроорганізмів.

Подальший розвиток весьмаперспектівного імунохімічного напрямку багато в чому залежить від хіміків, які повинні розробити досить яскраві нові барвники, вступають всоедіненія зі специфічними антитілами і антигенами. В результаті можуть битьполучени препарати з новими феноменологічним властивостями, позволяющіміпроводіть експрес-індикацію мікробних культур та окремих клітин з помощьюшіроко поширених мікроскопічних пристроїв (типу МБІ разлічнихмарок).

5. Іммуноферментноенаправленіе, інтенсивно розвивається в останні роки. Розроблено прямий, непрямий, антікомплементарний і інші методи швидкого виявлення мікробовпутем використання іммуноензімологіческого принципу- запропоновані нові відиферментов, а також різноманітні види хромогенних субстратів. Дане направленіеявляется вельми перспективним, розвиток його може привести в найближчі роки допояви нових методів експрес-індикації мікроорганізмів.

6. Іммуноелектрофоретіческоенаправленіе успішно розвивається з кінця 50-х років. Розроблено многочісленниеметоди іммуноелектрофореза. Однак для цілей експрес-індикації мікробів чащепрібегают до зустрічного іммуноелектрофореза. Застосування нових хіміческіхкрасітелей, ферментної або радіоактивності дозволить різко повисітьчувствітельность методу іммуноелектропреціпітаціі.

7. Іммунорадіологіческоенаправленіе пов`язано з використанням різноманітних кон`югатів спеціфіческіхантітел або антигенів, з`єднаних з радіоактивними речовинами, які прідаютім нові феноменологічні властивості і здібності, розширюючи возможностіекспресс-индикационного методу. Значні перспективи має подальше развітіеіммунорадіологіческого напрямки, так як воно безсумнівно приведе до созданіюнових, простих методів експрес-індикації мікроорганізмів.

8. Мікроцітологіческоенаправленіе швидкого цітоморфо-логічного аналізу пов`язано з іспользованіемсветлопольной, фазово-контрастної або люмінесцентної мікроскопіібактеріологіческіх мазкових препаратів, оброблених і забарвлених барвниками, що дозволяють швидко ідентифікувати мікроорганізми по їх морфології іспецифічні структурних елементів мікробної клітки. Дослідженню подвергаюткак нативний (гній, мокротиння, сеча, СМЖ, різні ексудати і ін.), Так іобогащенний (наприклад, центрифугуванням, фільтруванням і іншими методами) патологічний матеріал.

9. Бактеріологіческоенаправленіе пов`язано з прискореним виділенням і накопиченням бактеріальнихпопуляцій патогенних, умовно-патогенних і санітарно-показательнихмікроорганізмов. Воно засноване на використанні оптимальних ростових пітательнихсред, що містять необхідні біостимулятори, для прискореного полученіябактеріальной культури і часткової їх ідентифікації по совокупностікультуральних ознак.

10. Фагодіагностіческоенаправленіе, яке передбачає, з одного боку, ідентифікацію мікробів з допомогою специфічних індикаторних бактеріофагів, а з іншого, - виявлення ііндікацію специфічних фагів в патологічному і другом матеріалах з помощьюіндікаторних мікробних культур.

Прискорена фагодіагностіка вряді випадків є необхідним і корисним методом, що дозволяє значітельносократіть терміни досліджень і встановити природу збудника навіть в тих випадках, коли іншими методами, на увазі його мінливості або загрязненностіматеріала, він залишається нерозпізнаним.

11. Біологіческоенаправленіе, пов`язане з вивченням токсичних і агресивних властивостей патогеннихмікроорганізмов. Біологічні методи здійснюються на одноклеточнихорганізмах, на культурах клітин, курячих ембріонах, а також на здорових, а ещелучше спеціально підготовлених лабораторних тварин. Ці методи болеетрудоемкіе і менш точні в порівнянні з іншими.

12. Фізико-хіміческоенаправленіе. Цей напрямок пов`язаний з використанням порівняно швидких, але вто же час і досить складних за апаратурним оформлення методів. Сюдавходят методи вивчення бактеріальних популяцій і їх екстрактів з помощьюхроматографіі (газорідинна та ін.), Спектроскопії (інфрачервоної, ультрафіолетової та ін.), Резістографіі по відношенню до різних антибіотичних, хімічних і лікарських речовин, а також методи температурної і кіслотнойагрегаціі, коагуляції мікробних суспензій і їх токсинів.

13. Рецепторное ігенетіческое напрямки швидкої індикації патогенних і санітарно-показательнихмікроорганізмов. Методи, засновані на цих принципах, тільки начінаютразвіваться. Так, за допомогою целюлозно-глобулинового іліерітроцітарно-глобулинового діагностикумів швидко виявляють патогеннийстафілококк, що містить білок А, а шляхом гомології невідомих нуклеіновихкіслот з відомими нуклеїновими кислотами встановлюють вид патогена.

14. Комплексне направленіеускоренной ідентифікації патогенних і санітарно-показових мікроорганізмів, що використовує методи експрес-індикації, засновані на інтеграції разлічнихпрінціпов, пов`язане з розробкою і створенням індикаторних тест-систем, що дозволяють протягом короткого терміну і з мінімальними витратами на аналізопределіть комплекс основних ознак патогена або санітарно -показательногопредставітеля, достатніх для його ідентифікації до роду, виду і дажетіпа.

15. Напрямки, пов`язані сразработкой нових принципів мікробіологічного аналізу. Цілком ймовірно, і мивправе очікувати в найближчі 5-10 років появи нових ідей, підходів і принципів вмікробіологіческой науці і суміжних з нею областях. Відкриття нових відоврецепторной, імунологічної та генетичної специфічності у мікробів позволітсоздать нові і можливо більш досконалі методи швидкої ідентіфікаціімікроорганізмов.

1) створення іконструірованіе нових препаратів, що сприяють прискоренню і удешевленіюісследованій, підвищенню ефективності лабораторної діагностики інфекцій ііндікаціі патогенних та інших мікроорганізмів. На цьому шляху належить сделатьочень багато, оскільки загальноприйняті діагностичні препарати в значітельнойстепені вичерпали свої потенційні можливості-

2) розробка нових болеечувствітельних, простих методів лабораторного аналізу.

3) розробка комплекснихметодов і видів досліджень. Триватиме подальша інтеграція методів івідов досліджень, що мають різні принципи дії, що лежать в іхоснове-

4) створення нових схемісследованій. Оскільки лабораторна діагностика інфекційних хвороб, а такжеекспресс-індикація, хоча і в меншій мірі, пов`язані з вивченням комплексаразлічних властивостей і особливостей мікроорганізмів з використанням обичноразнообразних методів і прийомів, заснованих на різних принципах, то створеннянових схем досліджень із застосуванням нових методів є об`ектівнойреальностью і важливим завданням , яка витікає із суті самого процесу развітіямікробіологіческого аналізу-

5) розробка і створеннянових методів реєстрації та обліку результатів експрес-индикационного ілабораторних досліджень.

6) розробка новоймікромініатюрной лабораторного посуду, апаратури і приладів дляісследованій-

7) автоматизація ікомпьютерізація досліджень.

В сучасних умовах етівопроси повинні вирішуватися комплексно.

Таким чином, рассмотренниеосновние напрями та шляхи розвитку експрес-індикації мікроорганізмів в періодсовременного науково-технічного прогресу природничих наук безумовно получатдальнейшее прискорений розвиток, а мікробіологічна лабораторна практікаобогатітся новими швидкими методами індикації мікробів.

Експрес-діагностика холери

Холеру викликають два біовараVibrio cholerae. Один з них, виділений Кохом в Єгипті в 1883 році, назваліклассіческім, інший, отриманий Ф.Готшліхом на карантинній станції Ель-Тор у Північній Африці в 1906 році - V.eltor. обидва биовара неагглютінірующіеся вібріони (нагі), галофільні парагемолітічеських вібріони, які продукують гемолізини, інехолерние вібріони-кислотоутворювачами включені в рід Vibrio семействаVibrionaceae.

Це гостра кішечнаяінфекція, що супроводжується різким зневодненням і обессоливанием організма.Істочніком інфекції є людина - хворий або носій. Механізм передачіфекально-оральний.

Збудники імеютсоматіческій О-і жгутикових Н-антигени. О-антиген має видовий і тіповойспеціфічностью. За будовою О-антигену розрізняють довше 40 сероваров.Развівающійся до холери імунітет носить гуморальний характер.

Матеріал для дослідження: випорожнення, блювотні маси, трупний матеріал.

Метод масового ісследованіяю вибриононосительство. Матеріал береться безпосередньо з кишечника припомощи скляної трубочки діаметром 0,5 см (для дітей), 1,5 см (для дорослих) ідліной 15 см з оплавленими кінцями (при відсутності трубочок використовують ватниетампони на дерев`яних паличках). Трубочку негайно занурюють у флакон, що містить 100 - 200 мл 1% пептонною води і агглютинируют холерну О-сивороткув розведенні до половини її титру. В один і той же флакон беруть матеріал від 10ліц. Флакони поміщають в термостат при 370С. Через 3 - 4 години холерні вібріониначінают агглютинироваться і поступово (протягом найближчих 2 годин) падають у вигляді пластівців на дно флакона. Досліджуючи під мікроскопом пофарбовані мазки і "висячу краплю", виявляють склеєних і частково вільних вібріонів. Через6 годин дається відповідь і в разі виявлення холерних вібріонів немедленнопроізводітся посів індивідуально від кожного з 10 осіб. Такий метод даетвозможность досліджувати до 16 000 чоловік за 3 - 4 дні.

Метод іммунодіагностіческоймікропленкі. Вивчення антигенних властивостей холерних вібріонів проводять путемпостановкі пробіркових або пластинчастої реакції аглютинації з іспользованіемсухіх ліофілізованих діагностичних аглютинативна холерних 0-сироваток ісивороток Огава і Інаба. Сироватку розводять у фізіологічному розчині ілідістіллірованной воді і змішують при постановці аглютинації на склі сісследуемой культурою вібріонів. При підготовці сироватки іспользуетсядополнітельная посуд, що ускладнює роботу бактеріолога, а в оставшейсяразведенной сироватці швидко проростає бактеріальна мікрофлора і інактівіруетее.

Для вивчення антігеннойструктури холерних вібріонів були розроблений імунодіагностичних препарат у вигляді мікроплівок разового застосування, який володів достаточнойспеціфічностью, демонстративністю і економічністю. Іммунодіагностіческіехолерние мікроплівку (ІХМП) у вигляді полімерної плівки з нанесеними висушеннимікаплямі, фіксованими на папері, містять мінімальну кількість сироватки, плівкоутворювальний компонент і консервант. Плівкоутворюючий компонент пов`язує, склеює і фіксує микроколичества інгредієнтів до поверхні носія, виключає крошение мікропленок- консервант охороняє препарат від разрушеніяпрі тривалому зберіганні.

Концентрація діагностіческойсивороткі в ІХМП є достатньою, оскільки після емульгування в каплефізраствора, антитіла містяться в титрі 1: 100, що повністю забезпечує ходреакціі. Тим самим забезпечується достатня концентрація антитіл, знижується, витрата діагностичної сироватки і виключається можливість її неіспользованія.Прі цьому створюються умови для швидкого розчинення ІХМП, контакту її схолернимі вібріонами і проведення реакції безпосередньо на полімернойпленке.

Готові ІХМП зберігають в темномсухом місці при 4 7 ° С в картонних коробках (термін придатності 3 роки - срокнаблюденія) і в міру потреби ІХМП використовують для визначення холернихвібріонов. Для виключення випадкового зараження навколишніх предметів ІХМПпомещают в чисту чашку Петрі. На поверхню ІХМП наносять каплюфізіологіческого розчину, в якій розчиняють її. Розведену сивороткусмешівают з досліджуваної культурою вібріонів, знятої бактеріологічної петлею спітательной середовища. При іншому варіанті постановки реакції ІХМП снімаютскальпелем з паперової підкладки і переносять на предметне скло, розчиняють вкапле фізіологічного розчину і змішують з досліджуваної культуройвібріонов.

При позитивній реакціічерез 1-3 хв з`являються зерна агглютіната, пофарбовані в зелений колір, а капляпросветляется. При негативній реакції крапля залишається гомогенно-каламутній.

Використану частьполімерной плівки відрізають, а частину, що залишилася плівки з ІХМП зберігають в тій жечашке Петрі для подальших досліджень. Використання ІХМП в ісследованіяхвібріонов та інших мікроорганізмів дозволяє отримати статистично достоверниерезультати, заощадити дорогі діагностичні сироватки, повисітькачество і ефективність досліджень.

Реакція агглютінаціімікрометодом. Останнім часом у бактеріологічній практиці знайшов довольношірокое застосування мікрооб`ємні метод постановки серологічних реакцій сиспользованием спеціальних планшеток і мікротітровальних голок.

Реакції агглютінаціімікрометодом ставлять з холерними аглютинативна референс-сироватками вполістролових мікротітровальних планшетка з плоским або V-образ-ним дном, призначених для імунологічних реакцій, використовуються мпкротітровальниепланшеткі з об`ємом лунок 0,4 мл і в пробірках паралельно. Предварітельнопланшеткі ретельно промивfют проточною водою, кожну лунку прополасківалідістіллірованной водою і добре просушивали, потім робили написи простимкарандашом.

У всі лунки чотирьох рядовпіпеткой-крапельницею з мікротитратор Такач вносять 0,85% розчин хлорістогонатрія (рН 7,2) в обсязі 0,05 мл, потім в першу лунку кожного ряду - того жеоб`ема відповідної сироватки в розведенні 1:25 і проводять її тітраціюмікротітроваль -ної голкою з головкою (обсяг 0,05 мл), видаляючи з останньої лункіпо 0,05 мл.

Після титрации сироваток зовсім лунки, крім їх контролів, вносять 0,05 мл суспензії досліджуваної агаровойкультури. Цю маніпуляцію проводять на підносі.

Після закінчення тітрацііпланшет накривають кришкою і ставлять на підносі в термостат при 37 ° С. После2-годинної експозиції проводять остаточний облік реакції під стереомикроскопом (МБС-1, МБС-2) в косопроходящем світлі. При обліку реакції кришку з планшетки знімаються, в разі її запотівання замінюють на іншу.

Після обліку реакцііпланшетку і кришку складають в кювет і заливають 5 "% хлораміном так, щоб вселункі планшетки були заповнені дезрозчином.

Дослідження показали, чтовсе холерні вібріони класичного і ельтор биоваров агглютинируются холернойвідовой 0-сироваткою в мікрооб`ємах.

Що касаетсяагглютінабельності типоспецифічними сироватками, то простежується следующаязакономерность:

при постановці з сивороткойІнаба в мікрометодом агглютініровалісь 100, а в пробірках-90% штаммовклассіческого холерного вібріона серовара Інаба. Холерні вібріони біовараельтор серовара Інаба агглютініровалісь в планшетка і пробірках відповідно 95 і 96% випадків. У холерних вібріонів класичного і ельтор біоваровсеровара Огава співвідношення в обох методиках були практично ті ж.

Цікавий факт, що пріпостановке реакції аглютинації з RO-сироваткою найбільше число штамів, аглютинативна RO-сироваткою до титру, було виявлено в мікрометоде- впробірках аглютинація встановлена в одного штаму.

Всі штами вібріонів 040-056сероваров в мікрометодом НЕ агглютініровалісь холерними агглютінірующімісивороткамі, а в пробірках штам II 258-1099 (040 серовар) агглютініровалсявсемі холерними сироватками.

Більшість ізученнихштаммов представників сімейства Enterobacteraceae теж агглютініровалосьхолернимі аглютинативна сироватками, за винятком Sh. flexneri 2503, укоторого в пробірках була виявлена аглютинація з усіма сироватками, і штаммаS. typhimurium 21, у якого відзначена неспецифічна реакція аглютинації совсемі сироватками як в пробірках, так і в планшетка.

При користуванні цим методомрасход агглютинирующих сироваток зменшується в 10 разів, значно сокращаетсявремя, необхідне для постановки реакції, і прискорюється термін видачі ответа.Кроме того, описаний метод менш трудомісткий. Таким чином, стандартність, достовірність отриманих результатів, висока економічність методу позволяютрекомендовать його при ідентифікації холерних вібріонів, вивченні штамів іпопуляціі штамів холерних вібріонів за ознакою агглютінабельності.

А також:

Іммобілізація вібріоновхолернимі сироватками і типовими холерними фагами. Краплі випорожнень іліматеріала з поверхні пептонною води обробляють холерної О-сироваткою, типовими сироватками Огава та Інаба або типовими холерними фагами. Готують з ніхпрепарати "роздавлена крапля", які досліджують за допомогою темнопольной іфазовоконтрастной мікроскопії. У позитивному випадку через 3-5 хвилин двіженіевібріонов припиняється.

РИФ. Препарати ізісследуемого матеріалу обробляють флюоресцирующей протихолерної сироваткою іісследуют в люмінесцентному мікроскопі. Позитивним результатом счітаетсяобнаруженіе в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим жовто-зеленим свеченіемв вигляді блискучого обідка по периферії клітини. Позитивний результат можнаотримати через 1-2 години після початку дослідження при концентрації вібріонів не менш 106 клітин в 1 мл., Тому рекомендується заздалегідь подращіваніематеріала на поживних середовищах.

Експрес-діагностика туляремії

Збудник туляремії (Туляре - район Каліфорнії) - Franciella tularensis відноситься до роду сневиясненним становищем в систематиці мікробів. Етіологічна природа туляреміібила встановлена в 1912 році Г.Мак-якому і Ш.Чепіним, а далі докладно ізученаЕ.Франсісом.

Туляремія - важка кровянаязоонозная інфекція з природного осередкових. Основні джерела інфекції -водяние щури, ондатри, зайці, щури, миші. Хвора людина неконтагіозен і длявозбудітеля є біологічним тупиком. Передається трансмісивних путемчерез кліщів, а нерідко і контактним, аліментарним або аспіраціоннимпутем.

Збудник содержітнуклеопротеідний О-і оболончатий білково-ліпідний Vi-антиген. У перенесшіхболезнь виробляється дуже напружений і тривалий імунітет.

Матеріал для дослідження: кров, гній, пунктат бубону, слиз із зіву.

Реакціяагглютінаціі-розсіювання. Запропоновано проста, швидка, високочутлива іспеціфічная реакція аглютинації-розсіювання, для постановки которойіспользуется антитільний діагностикумів. Це суспензія темно-коричневого кольору, що представляє собою комплексне з`єднання кулястих крупнодісперснихНК-частинок (Нікітін і Котіч) і протівотуляремійних імуноглобулінів. Препаратхранят в холодильнику при + 4 ° С протягом 2-3 років. Після закінчення 3 років препаратможно ресенсібілізіровать, так як НК-частинки високостабільного.

Для постановки реакцііагглютінаціі-розсіювання на ретельно знежирене предметне скло наносятслева краплю досліджуваного матеріалу (досвід), праворуч - краплю фізіологіческогораствора або гетерологічного мікроба (контроль). Потім до крапель додають поодному краплі НК-антитільної туляремийного диагностикума. Перемішування капельпроізводят шляхом обертального руху предметного скла за годинниковою стрілкою ічерез 1 5 хв оцінюють результати реакції.

Облік і оцінка результатовпроізводятся неозброєним оком, а також за допомогою лупи і мікроскопа в теченіе1-5 хв. При позитивній реакції в разі наявності туляремийного мікроба іліего антигену в досліджуваному матеріалі в невеликих кількостях (до 1-3 млн постандарту ГКІ) відзначається феномен розсіювання кулястих НК-частинок по всейплощаді краплі, що реєструється під малим збільшенням мікроскопа, а пріконцентраціі 3-5 млн і більше - феномен освіти темно-коричневих зеренагглютіната, видимих неозброєним оком. При негативній реакції форміруетсячетко окреслений, темно-коричнева пляма або точка в центрі краплі.

Пропонована реакція сиспользованием туляремийного НК-діагностикумів призначена для бистроговиявленія специфічного антигену при дослідженні об`єктів зовнішнього середовища, харчових продуктів, трупів полеглих гризунів, а також в тих випадках, коли через замассівного пророста сторонньої мікрофлори або загибелі мікроба виділення егопосевом або через біологічну пробу не вдається. Реакція строго специфічна і дозволяє виявляти туляремійний мікроб в невеликих кількостях (300 тис. - 1 млн. М.к. / мл) або його антиген. А також ТІФМ і ін.

Експрес-діагностика чуми

Збудник чуми був откритв 1894 році в Гонконгу А.Іерсеном і в його честь був названий Yersinia pestis. Крод иерсиний відносяться також Y. pseudotuberculosis і Y. enterocolitica, що викликають септичні гастроентероколіти або ієрсиніози.

Чума - особливо небезпечна, оченьтяжелая кров`яна інфекція, схильна до широкого поширення і дає високійпроцент смертності (від 20 до 100%). Це зоонозних трансміссівнаяпріродно-осередкова інфекція. Джерела - пацюки, ховрахи, піщанки, полівки, бабаки, мишоподібні гризуни.

Переносники - кровососущіенасекомие.

У складі бактерій чумисодержітся понад півтора десятка специфічних і групових антігенов.Переболевшіе набувають довічний, стійкий імунітет фагоцітарногохарактера.

Матеріал для дослідження: вміст бубонної, відокремлюване виразок, харкотиння, кров, випорожнення.

Метод паперових індікаторнихсістем. Класичні методи (посів на середовища Гіссен) громіздкі, вимагають многовременной і великої кількості поживних середовищ, що мають обмежений срокгодності. В даний час ці методи не задовольняють запитам протівочумнойсістеми. В даний час найбільш перспективним методом определеніяферментатівной активності штамів збудника чуми з метою ідентіфікаціівиделяемих культур і вивчення їх властивостей можна вважати метод вуглеводно-бумажнихдісков, запропонований В.М.Нікітіним і С.В.Плугару. Як середовище лучшеіспользовать бульйон Хоттингера, тому що він дає найбільш швидку ферментацію - 3години. Доцільно застосовувати БІС в польових умовах, так як набори компактні імогут тривалий час зберігатися при кімнатній температурі.

Фаготіпірованіе. 1. Внесеніебактеріофага в досліджуваний матеріал у момент його посіву на агар сгенціанвіолетом дозволяє виявити під мікроскопом негативні колонії фага або "доріжку" в перші години, коли зростання бактерій ще майже не помітний (через 2,5 - 3години). Метод простий, доступний і дає хороші результати при високій концентраціічумного мікроба і при відносно великій зміст посторонніхмікроорганізмов.

2. Визначення нарастаніятітра чумного фага, внесеного в досліджуваний матеріал, де в разі налічіявозбудітеля фаг починає розмножуватися вже через 30-40 хвилин. У жідкійісследуемий матеріал (25-50-100 мл) і в контрольну рідину додають столькофага, щоб отримати його розведення 1:50 - 1: 100 ставлять проби в термостатах прі370C на 45-60 хвилин. Після інкубації беруть 0,5 мл рідини з кожної проби іразводят бульйоном в 10 раз-з цього першого розведення фага готують серіюпоследовательних 10-кратних розведень (до 10-10 - 10-11). За 0,5 мл рідини ізкаждого розведення досліджуваного і контрольного рядів додають до 2,5 млполужідкого агару (0,1%), попередньо розплавленого і потім охолодженого до48-500С. Тут же до агару додають 0,1 - 0,2 мл суспензії 1 - 2 суточнойіндікаторной культури (вакцинний штам чумного мікроба), що містить 15-20 млрдмікробов в 1 мл. Вміст пробірок ретельно перемішують і виливають на чашкіПетрі з 2% агаром Хоттингера. Після того, як напіврідкий агар застигне, чашкіперевертивают дном догори і ставлять в термостат при 370С. Облік результатовпроізводят через 3-4 години. На тлі суцільного зростання індикаторної культури віднистерільние плями (негативні колонії фага), кількість яких на чашках сісследуемим матеріалом може перевершувати в 100-1000 і більше разів чіслонегатівних колоній на контрольних чашках. Завдяки хорошій дифузії фаговихчастіц і бактеріальних клітин через напіврідкий агар двошаровий метод даетстерільние плями більшого розміру, ніж при розмазування досліджуваної массишпателем по поверхні агару. Підрахунок колоній ведуть в лічильної камері.

А також: РИФ, РПГА идр.

Деякі інші методи

Хемілюмінесцентнийіммуноаналіз. Новим етапом на шляху розвитку імунологічних методів діагностікіООІ є хемілюмінесцентний іммуноаналіз - ХЛІА. Перевага цього методаопределяется його високою чутливістю, відносної простотою іпроізводітельностью, можливістю повної автоматизації

У відкритій літературеімеются окремі повідомлення, присвячені застосуванню ХЛІА в медіцінскоймікробіологіі, як для виявлення бактеріальних антигенів, так і для поіскаспеціфіческіх антитіл

Мета нашої работизаключалась у відпрацюванні оптимальних умов постановки ХЛІА для ускореннойдіагностікі ГОІ, порівняльній оцінці цього тесту з загальноприйнятими реакціями -МФА, РПГА і тифу.

Об`єктами ісследованіяслужілі суспензії збудників чуми, сапу, меліоїдоза, бруцельозу і сибірки, знезаражені 0,5% формаліном, всього 100 штамів.

Специфічність препаратів іметоди контролювали на 42 штамах близькоспоріднених і гетерологічнихмікроорганізмов.

Як діагностіческіхпрепаратов для виявлення збудників чуми, сапу, меліоїдоза, бруцельозу ісібірской виразки в тифу і ХЛІА використовували специфічні імуно-пероксідазниекон`югати до відповідних збудників ОНІ, отримані методом перйодатногоокісленія на основі імуноглобулінів з кролячих імунних сироваток іпероксідази, робоче розведення яких становили відповідно 1: 200 1: 300 и1: 1000-1: 1500.Подготовку і постановку тифу і ХЛІА здійснювали общепрінятимспособом як субстратів використовували: для тифу - о-фенілен Ямім, дляХЛІА - суміш люминола з перекисом водню і р-йодфенола. Постановку МФА і РПГАпроводілі по загальновідомою методикою.

Результати тифу і РПГАучітивалі візуально, МФА - за допомогою люмінесцентного мікроскопа, ХЛІА - налюмінометре.

Чутливість ХЛІА на 1-2порядка вище, ніж тифу і на 2-4 порядки перевищує чутливість общепрінятихтестов - МФА і РПГА. При цьому метод досить специфічний.

Хемілюмінесцентний аналізпрі використанні автоматичних приладів постановки і обліку результатовотлічается економічністю і високою роздільною здатністю, заслужіваетвнедреніе в практику медичних і ветеринарних лабораторій.

Специфічність ХЛІА зависитот якості використаних імуноглобулінів. На 42 близькоспоріднених ігетероло-гічної штамах позитивні реакції отримані з Y. pseu-doTuberculosis816111 (37 °) з чумними загальними ІПК і В. sereus 1 і 3 з сібіреязвеннимі ІПК вконцентраціях 1 -106 м. Т. / Мл.

ХЛІА слід рекомендоватьдля лабораторної діагностики ГОІ особливо в тих випадках, коли в ісследуемомматеріале передбачається незначний вміст збудника.

Іммуноблотінг.Іммуноблоттінг - різновид гетерогенного імунного аналізу. Сутність егозаключается в перенесенні молекул досліджуваної речовини з одного твердого носія, використовуваного для фракціонування біополімерів, на інший, де з помощьюіммунохіміческой реакції відбувається їх специфічне виявлення.

Залежно отісследуемого речовини розрізняють ДНК, - РНК і білок - блот.

При постановкеіммуноблоттінга дотримується наступна методична послідовність: електрофоретичної поділ аналізованого матеріалу на індивідуальні білки поліпептиди в геле- отримання репліки шляхом блот білків іліполіпептідов з гелю на твердофазних матрікс- блокування фону, відмивання откомпонентов, використовуваних при блокуванні фона- инкубирование зі спеціфіческойтест-сивороткой- відмивання від надлишку сивороткі- инкубирование з Jg до антітеламспеціфіческой тест-сироватки, кон`югованими з меткой- відмивання від хати ткамеченого іммунореагента- виявлення тестованих антигенів авторадіографіческімі іліферментатівно по реакції з відповідним субстратом.

Імунохімічної виявленіеантігенов можна проводити за допомогою антитіл, кон`югованих з міткою. Вкачестве мітки останнім часом широко застосовують або радіоактивні ізотопи, або ферменти (пероксидазу, лужну фосфатазу, лактамазу і ін.).

Час блоттинга путемдіффузіі становить 36-48 год. Але найбільш швидкий і ефективний спосіб переносабелков з гелів - електроблот, час якого, в основному, становить 1-3 год (2), для деяких високомолекулярних білків-більше 12 ч.

Конкретний вибір сорбентовдля різних модифікацій блотів (нитроцеллюлоза або папір, обработаннаясоответствующім чином), вибір умов блокування та імуно-хіміческоговиявленія антигенів повністю залежить від антигену, його кількості, методаіммуноаналіза і цілей дослідження.

Метод ІБ з цілого рядуобстоятельств набув найбільшого поширення як метод, придатний длявикористання в якості тесту підтвердження.

Безумовне достоінствометода - можливість тестування антитіл до слабко або зовсім нерастворімимантігенам і виключення стадії введення радіоактивної мітки в антигени.

Про чутливості в случаеІБ судять за граничним кількістю нанесеного на гель антигену, яке пріфракціонірованіі білків вдається виявити імунохімічний після перенесення з гелю натвердо фазу (нитроцеллюлозу). Загальна чутливість аналізу залежить від целогоряда причин: умов фракціонування та іммобілізації антигену на твердомносітеле, рівня фону, специфічності і афінності антитіл. Важливе значення імеетвід використовуваної мітки та спосіб її виявлення.

Таким чином, методіммуноблотінга дозволяє ідентифікувати зони антигену на твердій фазі, несвязивая весь білок з антитілами специфічної сироватки. Іммуноблотінга і егомодіфікаціі в основному використовуються для типування бактеріальних і віруснихантігенов і антитіл, особливо в разі недостатньої роздільної способностіобичних систем, а також при аналізі імуноглобулінів, нуклеїнових кислот або кактест підтвердження в поєднанні з іншими методами.

Виявлення збудників, антигенів і антитіл за допомогою суспензійний препаратів. Принцип: фіксірованниена частинках компоненти вступають в реакцію антиген-антитіло, котораясопровождается утворенням великих, видимих неозброєним оком агломерацій. Всуспензіонних препаратах для виявлення і кількісного визначення антігенові антитіл використовується властивість багатьох неорганічних і органічних речовин, таких як активоване вугілля, дерматол, бентоніт, каолін, гідроокис алюмінію, силікати, сульфат барію, полістирол і т. Д. Фізично сорбировать біополімери насвоіх поверхні.

В. Нікітіна пріменілацветние целюлозні антигени для прискореної діагностики чуми і туляремії, які за 5-10 хвилин дають можливість в реакції непрямої агглютінацііобнаружіть імунні антитіла. Eisler показав, що тваринне вугілля адсорбіруетантітела проти холерного гемолизина. Величина адсорбції антігемолізінов зависитот титру антигемолітичної сироватки. Тваринний вугілля інтенсивно адсорбіруетантігемолізіни з сироваток з невисоким титром антитіл. Із зростанням тітраантігемолітіческіх сироваток інтенсивність адсорбції антігемолізінов углемуменьшается. Деревне вугілля або частинки хімічно чистого вугілля можуть бутивикористані як носії антитіл аналогічно латексу і бентоніту. Препарати тіпаугольних сироваток володіють двома цінними властивостями: вони зберігаються длітельноевремя в сухому вигляді і не потребують додавання консервантів. Як показаліісследованія Р. X. Яфаева, антитіла можуть бути фіксовані на поверхні частіцактівірованного вугілля адгезійним методом - шляхом прикріплення антитіл до частіцампленкой денатурованого білка. Суспензія частинок вугілля, содержащаяадсорбірованние антитіла специфічно агломеруються при додаванні до нейгомологічного антигену.

Використання аніонообменнойсмоли як носій антитіл знайшло застосування при виявленні возбудітелейхолери і везикулярного стоматиту. Частинки смоли, з`єднані з антитілами, агглютинируют при додаванні матеріалу, що містить спеціфіческійантіген.

висновок

Існує большоеразнообразіе методів експрес-діагностики особливо небезпечних інфекцій, заснованих нарізних принципах. Вибір того чи іншого повинен проводиться відповідно стехніческімі можливостями лабораторії, контингентом заражених людей, характером і масштабом поширення передбачуваної інфекції. Діагностікунеобходімо провести в найбільш короткі терміни, тому що від цього завісітеффектівность ізоляції та лікування хворих. При роботі з патологічним матеріаломважно враховувати і попереджати можливість зараження медичного персоналу, тому треба суворо дотримуватися інструкції по збору матеріалу від хворих.

Класичні методиекспресс-діагностики в більшості своїй вичерпали себе, у зв`язку з етімнеобходімо розробляти принципово нові, такі як ПЛР та ін. Іавтоматізіровать існуючі.

Таким чином, експрес-діагностика ГОІ і до цього дня залишається актуальною і однією з важнейшіхзадач мікробіології та епідеміології.

Список використаної літератури

• Прискорені методидіагностікі інфекційних хвороб (сб. Тр.) -Кішінев, "Штіінца", 1987.
• Препарати дляекспресс-діагностики (сб. Тр.) - Ленінград, 1981.
• Імунохімія і лабораторнаядіагностіка особливо небезпечних інфекцій (сб. Тр.) - Саратов, 1985.
• Щербак Ю.Ф. Особливо опасниеінфекціі - М., "Медицина", 1975.
• Рання і діфференціальнаядіагностіка основних інфекційних захворювань (уч.-мет. Посібник) -Ленінград, 1988.
• Медицина катастроф (Уч.пособие) - М., "ИНИ Лтд", 1996.
• Лебедєва М.М. Керівництво кпрактіческім занять з медичної мікробіології - М., "Медицина", 1973.
• Борисов Л.Б., Козьмін-Соколов Б.М., Фрейдлін І.С. Керівництво до лабораторних занять помедіцінской мікробіології, вірусології та імунології - М., "Медицина", 1993.
• Повловіч С.А. Медіцінскаямікробіологія в графах - Минск, "Вишейшая школа", 1986.

Увага, тільки СЬОГОДНІ!